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lunes, 2 de mayo de 2016

ELISA: resultados con incertidumbre.

Por: Bernardo Mejía Arango, M.V.Z.  M.Sc.
Fotografías e imágenes: Bernardo Mejía Arango, M.V.Z.  M.Sc. Protegidas por derechos de autor. Su uso o reproducción deberá contar con autorización previa.

ELISA es una técnica serológica en la que el suero solo es diluido una vez antes de ser procesado y se hace reaccionar con  un antisuero (Específico de especie)  marcado con una enzima. El resultado se basa en una reacción colorimétrica que es medida con un espectrofotómetro, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpos de la muestra y el titulo es calculado matemáticamente haciendo una comparación con los títulos de los controles positivos y negativos. Los resultados son además clasificados  en un histograma en grupos (También llamados perfiles) los cuales van acompañados de cálculos  como el coeficiente da variación, que facilitan la interpretación del histograma. Hay muchas variantes de la técnica ELISA, en este artículo solo se considera ELISA indirecta, técnica para detectar y medir anticuerpos.

Vista la definición anterior, la técnica es muy fácil de entender, pero existe al menos es mi apreciación, mucha controversia cuando se utiliza la técnica de laboratorio ELISA indirecta  para detectar anticuerpos contra cualquiera de los agentes etiológicos que la información sobre la técnica dice que ella determina. No hay información sobre la sensibilidad ni la especificidad de la  prueba o técnica de laboratorio. Y las casas comerciales no tienen su explicación para ello, deben de tenerla, pero no la dicen por razones que se entenderán a lo largo de este artículo. En última instancia podría haber información  sobre la sensibilidad de la técnica ELISA para el diagnóstico serológico de enfermedades aviares, pero no sobre la especificidad (Que es prácticamente un secreto de las casas comerciales, por razones de  competencia entre ellas).  A partir de esta premisa se desarrolla el tema en este artículo.

La afirmación anterior sobre la especificidad de la técnica, genera en un momento determinado una serie de controversias sobre las cuales no se menciona casi nada por las siguientes razones:
  • Porque los Médicos Veterinarios que la emplean no conocen el fundamento de la técnica.
  • Porque las casas  comerciales no lo dicen o informan en sus insertos. Estos datos son parte del "dosier" de cada compañía.
  • Porque las casas comerciales incluyen en sus insertos unos datos sobre positividad de las muestras (En condiciones de laboratorio para  obtener controles positivos para la técnica) que no corresponden a lo que realmente sucede en el campo.
En la práctica, hay dos enfermedades aviares para las que se utiliza la técnica ELISA  con más frecuencia y pueden ser dos enfermedades sobre las cuales hay más controversia en este sentido: bronquitis infecciosa aviar y  enfermedad de Gumboro.

Emplear la técnica serológica ELISA en el diagnóstico aviar tiene varias implicaciones y se puede usar con diferentes fines.

Para iniciar el tema sobre la técnica serológica ELISA en diagnóstico aviar, necesariamente hay que entrar a analizar conceptos preliminares como el de sensibilidad y el de especificidad. Una vez entendido esto, veremos qué implicaciones  tiene en relación con la técnica ELISA.

SENSIBILIDAD:  es la probabilidad de clasificar correctamente un individuo enfermo, es decir la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba de laboratorio, un resultado positivo. (El concepto de sensibilidad está unido además a la cantidad muy pequeña de anticuerpo, en el caso de ELISA indirecta, que la técnica  es capaz de detectar, por eso igualmente se dice que son muy sensibles)

La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la enfermedad.

ESPECIFICIDAD:  es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo.

En otras palabras, se puede definir la especificidad como la capacidad de un test  para detectar a los sanos.

Figura No. 1    La conformación de los determinantes antigénicos o epítopos (Epítopes) que son las macromoléculas que son reconocidas por el sistema inmunitario son  las que finalmente determinan la característica del anticuerpo que el sistema inmunológico  y que un organismo sintetiza como respuesta a la agresión por parte de una agente etiológico, en este caso un virus. En este sentido, antígeno y el anticuerpo que se forma a partir de él, son complementarios para que la respuesta inmunológica sea exitosa.

Esta propiedad es llevada a las placas del sistema ELISA en condiciones de laboratorio para producir una serie de reacciones  que finalmente generan un color que es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo y que debe ser inmunologicamente complementario para que esta reacción se produzca. El color  y por tanto la cantidad de anticuerpo se mide en un espectrocolorímetro.

En la figura, los anticuerpos IgY de las aves (Mal llamados IgG como los de los mamíferos) deberan ser específicos con relación al agente (Virus en este caso) que indujo su formación. Igual que lo que sucede en el sistema inmunitario de las aves, se produce en las placas ELISA.

(El concepto de especificidad es igualmente aplicable en el sentido de que en la técnica, el antígeno de las placas es capaz de reaccionar con anticuerpos cuya formación se indujo por un epítope de  un agente etiológico y no en otros del mismo tipo de virus que puede tener variaciones (en los epítopes) de su fracción antigénica  (Lo que genera nuevos variantes dentro de un serotipo). 

En otras palabras, ELISA es específica en la medida en que sea capaz de detectar anticuerpos contra sectores muy específicos de fracciones antigénicas de agentes etiológicos (En este caso de virus) que comparten características en estas fracciones antigénicas. Es el caso del virus de la enfermedad de Gumboro: las técnicas pierden especificidad en la medida en que el virus de campo evoluciona y genera variaciones en la proteína VP2.

Si se colocan los resultados de una prueba o test de laboratorio (Positivo y negativo) en una tabla de contingencia de 2 x 2 enfrentando estos resultados con el verdadero diagnóstico (Enfermo y sano), tendremos las siguientes opciones:
  1.  Que un animal positivo (En el test)  esté enfermo, es decir  es un verdadero positivo.
  2.  Que un animal positivo (En el test) esté sano, es decir es un falso positivo.
  3.  Que un animal negativo (En el test) este enfermo, es decir es un  falso negativo.
  4.  Que un animal negativo (En el test) esté sano, es decir es un verdadero negativo.
Figura No. 2: tabla de contingencia de 2 x 2 en la cual se enfrentan los resultados de una prueba o técnica diagnóstica (Positivo-negativo) contra el verdadero diagnóstico (Enfermo-sano). Con base en esta tabla, los epidemiólogos  transformaron a términos numéricos los conceptos de sensibilidad y de especificidad.

 De acuerdo con lo expuesto en la figura o tabla podremos entender  en términos matemáticos el significado de sensibilidad y de especificidad, así:

SENSIBILIDAD:   es la fracción de los verdaderos positivos (Enfermo con resultado positivo) que se obtiene de la fracción que resulta entre los verdaderos positivo sobre los verdaderos positivos + los falsos negativos.

ESPECIFICIDAD:   es la fracción de los verdaderos negativos (Sano con resultado negativo) que se obtiene de la fracción entre los verdaderos negativos sobre la suma de los verdaderos negativos + los falsos positivos.

ELISA  es tenida como técnica serológica en avicultura y como una herramienta valiosa:
  • Como referencia para  tendencias de seroconversión en una empresa avícola con desafíos de campo.
  • Para identificación de seroconversión rápida en muestras duplicadas (Pareadas) de animales enfermos y convalecientes en una situación diagnóstica.
  • Para evaluación de vacunas y procedimientos de  aplicación de vacunas.
  • Para tener claridad diagnóstica: por ejemplo cuando dos grupos de aves tienen sintomatología similares pero etiologías diferentes. 
  • Para documentar la  ausencia de anticuerpos contra los agentes patógenos como el virus de la gripe aviar, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae.
PARA ENTENDER PORQUÉ ESTAS PREMISAS NO SON SIEMPRE APLICABLES, DEBEMOS ENTENDER PRIMERO LA  TÉCNICA ELISA Y SU FUNDAMENTO.

La mayoría de los test o pruebas ELISA que se usan en avicultura corresponden a ELISA indirecta que es aquella técnica en la que se miden anticuerpos basados en el principio de que si estos existen en el suero sanguíneo de las aves, van a reaccionar con un antígeno que está pegado en el fondo de los pozuelos de una placa (Que tiene 96 de esos pozuelos). Esto se puede visualizar  gracias al ingenio de los que desarrollaron y estandarizaron la técnica para los diferentes agentes patógenos.

Figura No. 3. Se esquematiza la secuencia de eventos que se suceden cuando se  realiza el montaje de la técnica ELISA de conformidad con el manual de procedimientos de la técnica. Para que haya un "acoplamiento" (entre el antígeno que está pegado en el fondo o base de los pozos de una placa en la cual se monta la técnica) o reacción antígeno-anticuerpo-antianticuerpo y se genere color a partir de la enzima que está pegada al antianticuerpo (Conjugado), el antígeno debe ser homólogo con relación al anticuerpo que se está tratando de medir.

En la figura No. 3:  se  representa esquemáticamente lo que sucede en uno de los pozuelos de las bandejas o placas en las que se monta la técnica (ELISA  indirecta):
  • El el fondo del pozuelo va pegado un antígeno; el kit comercial ya viene preparado con placas que tienen en el fondo de los pozuelos determinados antígenos (Virus o partículas virales) dependiendo de la enfermedad y agente actuante y de los anticuerpos que este despierta en el organismo afectado  que es lo que se quiera evaluar.
  • Se agrega suero diluido de las aves que se van a  analizar. Si estas aves fueron desafiadas por un antígeno (vacunal o virus de campo) y si tienen anticuerpos homólogos para el virus que indujo su  síntesis y este virus es igual al que está pegado en el fondo de los pozuelos, se produce una reacción antígeno anticuerpo.
  • La reacción antígeno-anticuerpo se puede visualizar adicionando un anti-anticuerpo que va marcado con una enzima. Este producto anti-anticuerpo marcado con una enzima se denomina conjugado. El conjugado es específico de especie. No se puede utilizar una técnica que tenga conjugado anti-pollo en otro género y especie  diferente.
  • La enzima que tiene el conjugado es capaz de reaccionar con un sustrato que se adiciona a los pozos después de haberse adicionado el conjugado.
  • Si el los anticuerpos que contiene el suero son homólogos con el antígeno que traen las placas, el conjugado y por tanto la enzima es capaz de actuar sobre el sustrato generando un color en los pozuelos.
  • El color que se desarrolla es directamente  proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en el suero.
  • Si los anticuerpos que tiene el suero del ave no son específicos contra el antígeno que va pegado en el fondo de los pozos, no se produce la cadena de evento que finalmente termina desarrollando color como se explicó hasta el paso anterior, no se produce color y como no hay color, no hay nada que medir o en sentido exacto la medición da resultados negativos.
Figura No. 4:   en la parte media  inferior de la figura se muestra que cuando no hay acople o reacción antígeno anticuerpo (Porque el anticuerpo no es homólogo respecto del antígeno que está pegado en el pozo) no se produce la serie de eventos que terminan generando color que es directamente proporciona a la cantidad de anticuerpo y que es lo que finalmente se mide para estimar la respuesta por anticuerpos.

Entonces, el  contenido de un  pozuelo no desarrolla color por dos razones (Asumiendo que la técnica está bien montada):
  1. El suero no tiene anticuerpos contra el antígeno (Virus o fracción del virus) que está  pegado en las pozos  que componen la placa.
  2. El suero tiene anticuerpos pero la formación de estos no fue inducida por un virus similar al que tienen los pozos de la placa. Es decir no  son homólogos y por lo tanto no hay reacción antígeno-anticuerpo. Es un concepto de negatividad por "incongruencia" entre antígeno y anticuerpo, a diferencia de lo que sucede en el punto No. 1 en el que definitivamente no hay anticuerpos y por lo tanto no hay reacción.
Respecto de lo que se muestra en la figura anterior, pueden suceder dos situaciones:

1. Que el virus o en sentido estricto la fracción del virus que va pegado a las placas, pueda generar reacción cruzada con otros virus. Consecuencia: podríamos tener resultados erróneos en la serología (Esto es inespecificidad).

2. Ya representado en la figura: el virus o la fracción del virus que va pegado a las placas sea el virus causante de la enfermedad pero el serotipo es diferente: podríamos tener resultados negativos cuando en realidad no lo son. Esta ha sucedido con el virus de la enfermedad de Gumboro: se han dado casos con serologías negativas cuando en la evaluación histopatológica (Y mediante otras técnicas) los resultados son positivos. Algo igual está sucediendo con bronquitis infecciosa aviar.

Para continuar con el entendimiento  acerca de cómo se generan los datos en la técnica ELISA indirecta en el diagnóstico de enfermedades aviares, es necesario entender de donde salen las unidades de medida,  a partir de las cuales se obtienen finalmente los títulos (Es decir los niveles) de los anticuerpos. Esto es necesario para entender lo que el Médico Veterinario finalmente necesita saber: cuándo las aves están teniendo una respuesta serológica significativa.

Figura No. 5: esquematización de lo que sucede en uno de los pozuelos de una placa ELISA.

Figura No. 6:   esquematización  del proceso de montaje de la técnica ELISA, hasta llegar a la emisión de la tira (Señalada en un círculo y con una flecha roja) de papel en la cual están impresos los datos que se muestran en la siguiente figura (No. 5).

Figura No. 7: es una fotografía de una tirilla de papel que  emite la lectora en la que se muestran una serie de datos que finalmente dan origen al título o cantidad de anticuerpo, a la ubicación en un perfil o grupo y la  calificación de positivo o negativo. 

Esta calificación POSITIVO o NEGATIVO en la tirilla no debe ser tenida en cuenta para el caso de campo. Esta positividad es con relación a un suero que se preparó para la prueba, no dice  nada sobre la POSITIVIDAD en el campo, la cual debe ser medida frente a otro patrón.

La primer columna de datos  corresponde al número del suero a probar, incluye  dos controles negativos y dos controles positivos, los cuales van en los primeros cuatro pozos de la columna 1. La segunda columna identifica las coordenadas de cada pozo  se identifica con una letra para cada pozo de cada columna comenzando por la A y un número para cada pozo de cada hilera. En la columna 3 están las densidades ópticas. En la columna 4 se ubican las relaciones coeficiente muestra positivo o relación s/p. En la columna 5 están los títulos o cantidad de anticuerpos de cada suero. Columna 6: corresponde a los perfiles en el histograma al que corresponde el nivel del título. Columna 7: clasificación en positivo o negativo: esta clasificación se hace con base en un suero diseñado o escogido para la prueba, no la positividad de los sueros en el campo. 

Relación s/p o coeficiente muestra positivo.  Antes de producirse el resultado del título, hay que aplicarle un factor de corrección, que se hace utilizando el dato de las densidades ópticas el  resultado se llama coeficiente muestra positivo m/p o relación s/p.

El antígeno del control positivo ha sido estandarizado cuidadosamente de tal manera que representa cantidades significativas de anticuerpos en un suero positivo *. Las cantidades "relativas" de anticuerpos en las muestras de suero a evaluar, deben calcularse con referencia a este control positivo mediante la siguiente formula:


* El instructivo de cada técnica no dice contra que serotipo de virus, porque no explica cuál antígeno está pegado en el fondo de los pozos de cada placas. Así que estos valores de referencia, son para un virus o la variante de un virus  sobre el cual no tenemos información.

Una vez que se tiene la relación s/p, continúan los cálculos para obtener el título (Cantidad) de anticuerpos  en las diferentes muestras, lo cual se hace mediante la siguiente fórmula:


Todo este proceso lo hace la lectora de la técnica ELISA, la cual se programa de acuerdo  con el software que traen las casas comerciales. De hecho en estos software  vienen todos los cálculos explicados hasta aquí. Finalmente la tirilla que arroja la lectora, tiene una columna donde están los títulos, que la casa comercial  estableció mediante un PUNTO DE CORTE, es decir  un dato límite entre lo que se considera positivo y lo que se considera negativo.

Este número  no se puede tener en cuanta en términos de positividad y de negatividad. Es solo un dato que la casa comercial obtuvo a partir de un suero que la casa comercial puso como referencia pero que en condiciones de campo no  significa nada.

Si miramos en la tirilla de la  figura No. 7 en la que se ilustra como se obtuvieron los cálculos, una flecha roja señala el número o cifra 0.239 en las relaciones s/p como positivo, la cual corresponde en título de anticuerpos al número 481, que es finalmente el título para esa relación  s/p.  A partir de allí hacia arriba, los sueros son catalogados en la tirilla como positivos y de allí hacia abajo como negativos. Esa cifra 0.239  viene  a ser un punto de corte. 

Este concepto de POSITIVO será  válido para el suero control positivo empleado en la prueba, pero en condiciones de campo en nuestras explotaciones avícolas, no significa nada, ni en la enfermedad de Gumboro ni en bronquitis infecciosa: el título 481 (Que corresponde a la relación s/p 0.107) no es significativo frente a lo que manejamos en nuestro medio en condiciones de campo bien sea  como respuesta a una vacuna o bien sea títulos infectivos. Este valor de la tirilla no se debe tener en cuenta en la interpretación de la  prueba.

Existen varias interpretaciones acerca de los títulos considerados  como positivos en las diferentes explotaciones aviares en las que se usa ELISA como la técnica de diagnostico serológico. Quizá las enfermedades que más controversia pueden crear en cuanto a los resultados y en cuanto a la aplicabilidad de los mismos, son: bronquitis infecciosa aviar y enfermedad de Gumboro. Son dos de las enfermedades con las que más contacto tengo  como patólogo.

No se pueden extrapolar los datos de una granja a otra ni de un tipo de explotación a otro. Lo que en una granja o tipo de explotación es positivo, en otra puede que no lo sea.

Del doctor Jorge Alberto Escamilla Juarez, del Laboratorio Cordobés de Diagnóstico Pecuario S.A. se pueden citar las siguientes referencias:

Bronquitis Infecciosa: La prueba más utilizada es la ELISA, la presencia de anticuerpos maternos en pollitos de un día de edad indican protección. Pollos de engorda con un vacuna de virus vivo se esperan títulos de 500 a 2500. Aves de postura o reproductoras con 2 o 3 virus vivos se pueden obtener títulos de 10,000 o mayores.

Infección de la Bolsa de Fabricio: la prueba más utilizada es la ELISA. Anticuerpos maternos en pollitos de un día indican protección. En pollo de engorda con 1 a 2 vacunas a virus vivo se esperan títulos entre 500 a 2500 a la 5 semana de edad. En aves con vacunas emulsionadas se pueden tener títulos entre 5000 a 20,000.

http://www.lcdp.com.mx/publicaciones/resultados.pdf

Personalmente creo que esto sucede o se puede  tener como cierto si los anticuerpos que tienen circulantes las aves son homólogos con respecto al virus o a la fracción del virus que está pegado en los pozos de las  placas ELISA, es decir si  son específicos.

El Doctor  Gwenllyan Slacum de la compañía BioCheck USA Corp. tiene en la Revista MB Editores del 30 de mayo de 2014, una publicación sobre "El uso de la prueba de ELISA para Detectar Anticuerpos" El Dr. Gwenllyan midió en pollos de engorde vacunados in ovo a los 18 días de incubación y/o subcutáneamente al día de edad con diferentes vacunas recombinantes en herpesvirus de pavo (HVT) conteniendo genes para las proteínas inmunogénicas de los virus de la enfermedad de Newcastle, laringotraqueitis infecciosa y  enfermedad de Gumboro. Luego midieron a diferentes intervalos los niveles de anticuerpos.

Dice en su artículo el Dr. Gwenllyan, que el título promedio típico de anticuerpos contra el virus de Gumboro después de la vacunación en las condiciones mencionadas antes, tuvo un rango de 500 a 3.000 con una serovonversión de 80%, 35 días después de la vacunación. Después de desafiar las aves con un virus virulento, los títulos se incrementaron 6 veces en aves  debidamente vacunadas y 12 veces en aves susceptibles (No vacunadas?).
http://bmeditores.mx/el-uso-de-la-prueba-de-elisa-de-biochek-para-detectar-anticuerpos/

Estos resultados indican que el antígeno pegado en los pozuelos de las placas de ELISA era homólogo respecto de los anticuerpos. El virus de la enfermedad de Gumboro es un virus variante que en el tiempo y si las pruebas de ELISA no tienen un antígeno homólogo con relación al virus actuante en el campo, la detección va a tener niveles  o cifras bajas que se interpretarán como negativas cuando en realidad pueden no serlo.

Esto comenzó a suceder cuando a principios de la década de 1990 (Al menos en el suroccidente de Colombia),  en muchos casos cuando en la evaluación histopatológica las lesiones eran de enfermedad de Gumboro, las serología de esta aves tenían perfiles muy bajos o eran negativas. El virus estaba variando y ya no era detectado por las técnica ELISA. Debido a que esto ha sucedido paulatinamente en el tiempo, las casas comerciales se han dado cuenta de ello y cuando se les menciona la situación, sus representantes dicen que han cambiado los antígenos en los pozos y que hay  una especie de antígeno múltiple, lo que ellos llaman "de rango ampliado"; igualmente no dan información  específica acerca del antígeno en esas placas.

Encontré una  publicación hecha por profesionales del Grupo de Investigación en Microbiología y Epidemiología de la Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, en la cual utilizaron la técnica ELISA en un estudio de comportamiento del virus de bronquitis infecciosa en pollo con sintomatología respiratoria. Citan de manera general los siguientes títulos de anticuerpos como parámetros de interpretación de los resultados:
  • Aves sin vacunación con títulos superiores a 690 son considerados de exposición positiva al virus de la bronquitis infecciosa aviar.
  • Aves con vacunación se considera con exposición positiva cuando sus títulos son mayores a 2.000
No menciona nada relacionado con la sensibilidad y especificidad de la prueba, se remitieron a las especificaciones del fabricante del kit.

http://www.microclin.com/archivos/interpretacion_de_examenes_serologicos_en_campo_Dr_G_Zavala.pdf

El  Doctor Guillermo Zavala del Georgia Poultry Laboratory Network tiene una publicación muy interesante sobre la interpretación y aplicabilidad de los exámenes serológicos en condiciones de campo, se puede acceder al artículo mediante el siguiente enlace:
http://www.microclin.com/archivos/interpretacion_de_examenes_serologicos_en_campo_Dr_G_Zavala.pdf

En dicha publicación menciona aspectos importantes cuando se hacen estudios serológicos:  edades estratégicas, estacionalidad para el muestreo, la organización cronológica, el número de muestras por lote y los objetivos específicos. De este artículo extraigo las siguientes consideraciones sobre la técnica ELISA:
  • Las pruebas ELISA son muy eficientes en general para detectar tendencias, pero en muchos casos (Para muchas enfermedades no deben usarse como única herramienta diagnóstica).
  • Debe tenerse en cuenta que las pruebas ELISA son en general muy sensibles y por ello deben confirmarse los resultados positivos por otros medios cuando las  pruebas ELISA se utilizan como prueba diagnóstica. Tal es el caso de la influenza aviar, laringotraquitis, Pasteurella multocida y leucosis aviar entre otras.
En esta publicación, el Doctor Zavala tiene una sección "Aplicación de serología en situaciones aplicadas al campo". En el inciso 2 de esta sección (Evaluación de la respuesta a diferentes vacunas ) dice: "Si se desea evaluar por ejemplo diferentes vacunas inactivadas se oconseja utilizar pruebas más específicas, incluyendo HI y seroneutralización viral además de ELISA. Es muy importante incluir antígenos residentes pues los kits y antígenos comerciales podrían favorecer algunas vacunas sobre otras, siendo más importante evaluar la respuesta serológica contra antígenos o patógenos residentes en la región de interés"

http://www.microclin.com/archivos/interpretacion_de_examenes_serologicos_en_campo_Dr_G_Zavala.pdf

Estas consideraciones del Dr. Zavala, muy seguramente están relacionadas tanto con la sensibilidad, (que aunque él no suministra datos, afirma que ELISA es un técnica muy sensible), como con la especificidad. Creemos que lo que el Dr, Zavala afirma está relacionado con el hecho de que no sabemos que  antígeno está pegado a los pozuelos en las placas de ELISA  y por tanto la respuesta serológica detectada podría estar dirigida contra un serotipo de un antígeno paro no contra los demás serotipos.

Uno de los mejores artículos encontrados al revisar el tema de ELISA como técnica serológica es escrito por el Doctor Javier Torrubia Díaz. "Los resultados serológicos. Limitaciones y aplicaciones prácticas para la enfermedad de Gumboro". El doctor Torrubia explica las limitaciones y las aplicaciones prácticas para la enfermedad de Gumboro. Del artículo extraje  los siguientes items:
  • Existen diferentes kits comerciales. El kit seguramente más utilizado es de  origen norteamericano, utiliza como antígeno  el mismo que se usa en una vacuna intermedia clonada. Si se utiliza este kit y se ha empleado esta vacuna, los títulos son mayores que si se ha vacunado con otras cepas, por ejemplo la Lukert o la S-706
  • Hay otro kit  producido en Holanda. En condiciones normales genera títulos más altos que el primer kit mencionado.
  • Hay diferencias entre los kits y los anticuerpos detectados. El virus de Gumboro tiene una genoma que codifica para cinco proteínas: VP1 a VP5. la proteína VP2 tiene epítopes que son capaces de  inducir la formación de anticuerpos neutralizantes protectivos y son determinantes del serotipo; el sitio antigénico responsable está en una región pequeña conocida como dominio variable de VP2, altamente dependiente de la conformación. VP3 es una antígeno específico de grupo, reconocida por anticuerpos no neutralizantes, que pueden reaccionar en forma cruzada  con los demás serotipos.
  • Los kits clásicos utilizan en sus placas antígenos derivados  de cepas clásicas replicadas en cultivo de tejidos.
  • Los kits clásicos aunque detectan  casi todos los anticuerpos frente a las diferentes VP, sobretodo detectan  anticuerpos anti-VP3
  • Hay nuevos kits norteamericanos que utilizan un antígeno clásico de una cepa derivada de bolsas nativas, el cual permite una detección más precisa de los anticuerpos anti-VP2 protectivos.
  • En las vacunas vectorizadas, un gen que codifica para la proteína VP2 del virus de Gumboro  es vehiculizado en un virus diferente del de Gumboro (HVT o herpesvirus de pavo). Cuando la respuesta serológica inducida por estas vacunas se mide con los kits clásicos, la respuesta serológica es menor que la que se obtiene cuando las  aves se vacunan  con las cepas clásicas.
  • Cuando la respuesta por anticuerpos generada por vacunas vectorizadas se miden con  un kit adecuado (Diferente de los kits cláscos), la respuesta serológica es más temprana y mayor.
http://seleccionesavicolas.com/pdf-files/2012/1/6475-los-resultados-serologicos.-limitaciones-y-aplicaciones-practicas-para-la-enfermedad-de-gumboro.pdf

De lo planteado en los párrafos anteriores, se deduce  que hay que tener en cuenta el tipo de vacuna empleado y la técnica de ELISA empleada. Esto es para mejorar la probabilidad de que las cosas se están llevando a cabo en la forma adecuada; no obstante esto no soluciona el vacío que existe en el sentido de que no sabemos cual es la especificidad de ELISA, es decir no sabemos  si los anticuerpos son  bajos o la prueba es negativa porque los anticuerpos  no son homólogos con relación al antígeno pegado en los pozuelos de las placas.

En este sentido, el doctor Carlos Gómez D. Gerente de Aves y Cerdos para América Latina de una importante compañía productora de Kits de ELISA afirma lo siguiente:
  • "Actualmente existen 5 o 6 compañías líderes en el mundo que producen vacunas aviares de excelente calidad, esto no significa que una vacuna sea mala o buena".
  • "Lo que tenemos que ver es si elegimos la vacuna adecuada, si tenemos la información de la fórmula de esta, sabemos cuál es el título, sabemos cuál es la vía de aplicación adecuada, etc."
Hasta allí todo está bien. El asunto es que las técnicas  de diagnóstico, específicamente ELISA no indica la especificidad y llegamos a la misma  conclusión que en párrafos anteriores. Tenemos una incertidumbre, sobretodo cuando los títulos son bajos o  son negativos.

En lo personal, creo que cuando los expertos de una casa comercial productores de vacuna e inclusive productores de kits para el diagnostico serologico ELISA presentan la bondad de una técnica o de una vacuna, muestran resultados con base en la especificidad de la técnica respecto de la vacuna, es decir miden anticuerpos para una vacuna, con kits que tienen  antígenos homólogos respecto del virus usado en la vacuna. Esto no necesariamente sucede en el campo, donde pueden estar actuando otros virus de la misma enfermedad.

Hasta  aquí se presenta lo inherente a la técnica. Asumiendo que la técnica ELISA empleada va a dar los resultados adecuados en términos de especificidad, es necesario contar con herramientas adicionales a los resultados que arroja la tirilla de la lectora y que finalmente se presentan al usuario en forma de un histograma de frecuencia de los niveles de anticuerpos.

Los informes que emite el software con los que se leen las pruebas ELISA, deben mostrar los siguientes datos:
  • Media aritmética.
  • Media geométrica.
  • Desviación estándar.
  • Coeficiente de variación.
  • Título mínimo.
  • Título máximo.
Al menos se debe contar con la media aritmética y la desviación estándar; con estos dos valores se obtiene el coeficiente de variación que es el dato que finalmente permitirá comparar la concentración de los anticuerpos con respecto a la frecuencia de estos. Con la cifra obtenida se podrán hacer algunas afirmaciones  sobre los resultados

Figura No.8. Ilustra  el concepto de  coeficiente de variación que permite correlacionar la concentración de anticuerpos y su distribución en una curva de dispersión de datos.

El coeficiente de variación es una medida de dispersión útil para comparar dos escalas distintas que están correlacionadas estadísticamente con un factor común. El coeficiente de variación:
  • Permite analizar la uniformidad de los títulos de anticuerpos detectados.
  • Es un excelente método para determinar la efectividad de un programa de vacunación.
  • Indica la uniforme que fue el proceso de inmunización.
  • Permite evidenciar cuándo los títulos se salen  de los valores consideran normales.
  • Para establecer cuándo un lote es serológicamente positivo.
Este último punto "cuándo un lote es serológicamente positivo" no lo dice un solo análisis; asumiendo que la prueba es específica, se necesitan datos preliminares de una granja, de un conjunto de granjas o de una región: esto es materia de las líneas base.

En esta última afirmación es donde cobra importancia la especificidad de la prueba empleada; esto con base en que si los resultados no corresponden a los valores reales porque la técnica no es capaz de detectar los anticuerpos porque estos no son homólogos con relación al antígeno pegado en los pozuelos de las placas, se puede incurrir en falsas apreciaciones.

Tabla No. 1  Ilustra el rango de % del coeficiente y la calificación del mismo.
http://www.microclin.com/archivos/interpretacion_de_examenes_serologicos_ELISA_D_L_E_Ristow.pdf

En la tabla No. 1 se muestran los valores del coeficiente de variación y una calificación para los mismos. Esta tabla es una apreciación general acerca del significado de la cifra en la que se expresa el coeficiente de variación.

Cumpliendo la premisa de que se sabe contra que antígeno están dirigidos los anticuerpos detectados en la técnica ELISA, se pueden hacer aseveraciones respecto del coeficiente de variación. El coeficiente variación es inversamente proporcional a la media geométrica de los títulos. 
  • Si la media geométrica tiene cifras muy bajas, el coeficiente de variación tiene cifras altas: aves no vacunadas, con  un desafío bajo.
  • Si la media geométrica tiene valores  medios y el coeficiente de variación igualmente tiene valores medios:  se podría estar en el caso de un desafío con antígenos débiles, con el uso de vacunas vivas; el análisis se hace frente a los métodos de vacunación.
  • Si la media geométrica tiene valores altos, el coeficiente de variación debe tener cifras bajas. Posibilidades: el antígeno  vacunal es potente o se usan vacunas con diferentes adyuvantes, la media geométrica será alta y el coeficiente de variación bajo.
Figura No. 9. Las  técnicas o pruebas ELISA  comerciales no informan sobre la especificidad, es decir el usuario no sabe el tipo  antígeno viral que tren los pozuelos. Se podría tener una respuesta por anticuerpos con títulos bajos cuando en realidad no es así; no obstante esto no es completamente cierto pues puede darse reactividad cruzada.

El virus de la bronquitis infecciosa aviar es uno de los virus genéticamente más inestables, durante su replicación se producen seis ARN mensajeros por un mecanismo de transcripción discontinua (virus anidado), pudiendo ocurrir nuevas recombinaciones. Esto sugiere, que la población de virus de bronquitis infecciosa aviar está en un estado de cambio continuo en su genoma, específicamente en la región hipervariable del gen que codifica la porción S1 de la proteína de la espiga (S) y son los que dan lugar a nuevos serotipos.


Los Kits comerciales de ELISA pueden ser usados para monitorear la respuesta de anticuerpos del suero. Los antígenos usados en los kits tienen reactividad cruzada entre serotipos y esto permite el monitoreo serológico general de la respuesta a vacunas y desafíos de campo".
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n030310/031025.pdf

CONTRA QUÉ SE COMPARAN LOS VALORES OBTENIDOS EN UN EXÁMEN SEROLOGICO, ASUMIENDO QUE LA TÉCNICA ES ESPECIFICA?

Las cifras obtenidas en una serología ELISA, se den comparase contra una linea base, que:
  • Contiene la información necesaria para interpretar correctamente los resultados de pruebas serológicas, con base en  lo cual se toman decisiones
  • Es un  conjunto de datos que representan los niveles históricos o niveles iniciales de una cantidad medible. 
  • Es usada como base para comparar nuevos datos obtenidos subsecuentemente: por ejemplo la respuesta a una intervención o programa.
  • Debe ser usada en forma continua en una empresa.
  • Se debe  elaborar por granjas, por regiones identificadas geográficamente. 
  • Varía de acuerdo con el tipo de explotación (Ponedoras, pollo de engorde, reproductoras) y con la edad de  las aves.
  • Debe elaborarse  con resultados de aves sanas , con buenos indices de producción.
  • Se elaboran con base en el promedio geométrico.
  • Se debe trabajar con el mismo número de sueros.
  • Se debe elaborar con resultados del mismo laboratorio, en las mismas condiciones y con el mismo kit.
http://es.slideshare.net/seminarioavicola/interpretacion-serologia
http://www.actualidadavipecuaria.com/articulos/uso-de-la-serologia-como-herramienta-en-medicina-preventiva-aviar.html

Anteriormente se hizo referencia a un trabajo del Doctor Guillermo Zavala sobre interpretacion de exámenes serológicos.

http://www.microclin.com/archivos/interpretacion_de_examenes_serologicos_en_campo_Dr_G_Zavala.pdf

El doctor Zavala escribió una serie de consideraciones relacionadas con la técnica ELISA para una casa  comercial productora de kits para la prueba serológica y con base en ellas se elaboró un poster o afiche del cual se extrajeron textualmente estas:
  • ELISA es una  herramienta valiosa para observar tendencias de seroconversión.
  • Toda variación significativa en el desafío de campo o los enfoques de vacunación se pueden detectar con el uso de ELISA.
  • ELISA no determina subtipos de las respuestas inmunológicas contra cepas específicas variantes.
  • ELISA  no puede determinar si las aves de corral con problemas de bronquitis fueron desafiadas con un serotipo Massachusetts, Arkansas, Connecticut, DEO72, etc.
  • ELISA  no es una prueba cuantitativa en el sentido de que no puede determinar específicamente contra que cepa, serotipo o variante se dirigen los anticuerpos.
Imagen No. 1. Es una fotografía tomada del poster o afiche al que hacen mensión los párrafos anteriores.
  • Los valores del ensayo por ELISA se pueden usar del siguiente modo:
  1. Como referencia para tendencias de seroconversión en una empresa de avicultura con desafíos de campo.
  2. Para identificación de seroconversión rápida en muestras duplicadas de animales graves y convalescientes en una situación diagnóstica.
  3. Para evaluación de vacunas y procedimientos de aplicación de vacunas.
  4. Para documentación de la ausencia de anticuerpos contra agentes patógenos.
Figura No. 10. ELISA no presenta especificidad de cepa o de tipo, pero es adecuada para analizar respuestas de anticuerpos a la vacunación en condiciones de campo" (Conclusión tomada de la Tesis de Maestría "Evaluación prospectiva dela carga viral del virus de bronquitis infecciosa aviar en granjas de pollos de engorde con antecedentes de la enfermedad". Autores: Alvarez D. y Vera V. Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, 2009) 
http://www.bdigital.unal.edu.co/17725/1/13391-38750-1-PB.pdf

PUNTOS DE VISTA  SOBRE LA SENSIBILIDAD Y LA ESPECIFICIDAD DE LA TECNICA SEROLOGICA  ELISA EN  ENFERMEDADES AVIARES:

El Manual de la OIE sobre animales terrestres en la versión 2013,  en el capítulo 2.3.2 Bronquitis infecciosa aviar dice en  la página 8 al tocar el tema de análisis serológico mediante enzimoinmunoanálisis (ELISA): "carece de especificidad de cepa o de tipo pero es valioso para evaluar respuestas  a la vacunación en condiciones de campo"
http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/2.03.02_AIB.pdf

En una publicación de la Universidad Nacional Autónoma de México en relación con el diagnóstico serológico de la  bronquitis infecciosa aviar dice: " En virtud de las diferencias entre cepas de BVI (Bronquitis infecciosa viral), en algunos casos será conveniente utilizar en las pruebas de serología otras cepas distintas a la Massachustts 41 que es la más frecuentemente usada". 
http://www.fmvz.unam.mx/fmvz/cienciavet/revistas/CVvol6/CVv6c2.pdf

En la Revista Electrónica  Veterinaria REDVET, se encuentra en 2010 lo siguiente:

"El virus de la bronquitis infecciosa aviar es uno de los virus genéticamente más inestables, durante su replicación se producen seis ARN mensajeros por un mecanismo de transcripción discontinua (virus anidado), pudiendo ocurrir nuevas recombinaciones. Esto sugiere, que la población de virus de bronquitis infecciosa aviar está en un estado de cambio continuo en su genoma, específicamente en la región hipervariable del gen que codifica la porción S1 de la proteína de la espiga (S) y son los que dan lugar a nuevos serotipos. Esto podría ser consecuencia de presión inmunológica por el amplio uso de vacunas, infecciones mixtas (varios serotipos) o disminución del serotipo dominante"

"Los Kits comerciales de ELISA pueden ser usados para monitorear la respuesta de anticuerpos del suero. Los antígenos usados en los kits tienen reactividad cruzada entre serotipos y esto permite el monitoreo serológico general de la respuesta a vacunas y desafíos de campo".
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n030310/031025.pdf

"Colombia el año 2005, (donde) se estudiaron 16 aislamientos procedentes de aves padeciendo fuertes problemas respiratorios, resultando en que 12 de los aislamientos fueron clasificados en 4 genotipos diferentes a las cepas Mass y Connecticut". 
http://www.wpsa-aeca.es/aeca_imgs_docs/bronquitis_infecciosa_-_villegas,_p.pdf

"Elisa no presenta especificidad de cepa o de tipo, pero es adecuada para analizar respuestas de anticuerpos a la vacunación en condiciones de campo" (Conclusión tomada de la Tesis de Maestría "Evaluación prospectiva dela carga viral del virus de bronquitis infecciosa aviar en granjas de pollos de engorde con antecedentes de la enfermedad". Autores: Alvarez D. y Vera V. Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, 2009) 
http://www.bdigital.unal.edu.co/17725/1/13391-38750-1-PB.pdf

"La aparición continua de nuevos serotipos del virus de bronquitis infecciosa aviar ha complicado el diseño de programas de control apropiados, debido que la variación antigénica y al bajo grado de protección cruzada observada entre los serotipos del virus de bronquitis infecciosa aviar. Este hecho obliga a realizar un diagnóstico preciso de la enfermedad que incluya tipificación del serotipo involucrado en un brote".
http://www.cresa.es/cresa3/default.asp?mod=strmenu01&anio=2008&sub=noticia43&idioma=es

"Se desarrolló una prueba comercial de ELISA (Enzime-linked immunosorbent assay) empleando virus de la bronquitis infecciosa aviar sin purificar en la sensibilización de las microplacas. Los resultados indican diferencias en sensibilidad y especificidad de la prueba al amplear microplacas de diferente origen comercial" (Trabajo de Andrew N., Collingwodd-Selby y Toro G. y publicado en la revista Avances en Ciencias veterinarias Vol 7, No. 2 (1992)
http://www.revistas.uchile.cl/index.php/ACV/article/viewArticle/10433


Figura No. 11  La técnica ELISA para detección de anticuerpos contra la enfermedad de Gumboro fue quizá la primera en la que se comenzó detectar la falta de especificidad de la prueba: a comienzos de la década de 1990,  en algunos casos en los que eran evidentes  las lesiones de enfermedad de Gumboro en la bolsa de Fabricio, los  exámenes serológicos mediante la técnica ELISA mostraban títulos muy bajos, los cuáles eran  consecuencia de la presencia de nuevos virus como resultado de la variación antigénica.

La consecuencia de ello fue que  las pruebas ELISA se hicieron  inespecificas con relación a los virus actuantes en el campo. Hoy en día, las casas comerciales han sacado al mercado los kits con "rango ampliado", tratando de reducir esta inespecificidad. No obstante, no sabemos qué  antígeno viral, es decir qué tipo (O tipos) de virus está(n) pegado(s)  a las placas.

En el caso de la enfermedad de Gumboro sucede lo mismo en cuanto a la especificidad de la técnica: si no hay correspondencia entre los anticuerpos circulantes y el antígeno pegado en el fondo de los pozuelos de las placas de ELISA, no se produce la reacción antígeno-anticuerpo y la reacción no se puede visualizar de acuerdo con lo que se expone en párrafos anteriores  y en la figura No. 4.

En la enfermedad de Gumboro, la protección conferida por la vacunación está relacionada con la formación de la proteína viral 2 (Por sus siglas en inglés VP2), que es el mayor determinante antigénico del virus. La VP2 induce anticuerpos neutralizantes capaces de controlar la enfermedad y las características individuales de esta VP2 en las distintas cepas determina su fenotipo y su virulencia. Es por esto que se hace necesario caracterizar las diferentes cepas de  la enfermedad infecciosa de la bolsa de Fabricio circulantes en un área geográfica para establecer las medidas de control adecuadas
http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0798-22592010000100004

De hecho, cuando hay una infección de campo, la VP2 tiene una conformación que induce anticuerpos que inmunológicamente son complementarios con las características inmunogénicas de esa proteína, la cual varía de un tipo de virus a otro de la enfermedad de Gumboro. El kit ELISA que se usa en el laboratorio debe reproducir en sus placas lo mismo que sucede en condiciones de campo.

Cuál es su concepto?