martes, 7 de abril de 2015

DIAGNOSTICO CLINICO-PATOLOGICO EN AVES COMERCIALES. CONEXIONES ENTRE LOS CASOS DE CAMPO Y EL LABORATORIO DE DIAGNOSTICO.

DIAGNOSTICO CLÍNICO-PATOLÓGICO EN AVES COMERCIALES.
CONEXIONES ENTRE LOS CASOS DE CAMPO Y EL LABORATORIO DE DIAGNOSTICO
Delineamientos para el taller efectuado:

  • Dentro de la programación de la XXI Jornada Médico Avícola en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. 05 de marzo de 2015
  • En la Jornada de Actualización integral realizada por la Seccional Valle del Cauca de la Federación Nacional de Avicultores FENAVI. Santiago de Cali, Valle del Cauca, 8 de abril de 2015
Por: Bernardo Mejía Arango.  M.V.Z.  M.Sc.      bernardomejiaarango@gmail.com


Gráfica No. 1    Introducción.

A lo largo de mi intervención en el taller sobre diagnóstico clínico-patológico en aves comerciales, voy a presentar una serie de casos clínicos para relacionarlos  con las diferentes técnicas de diagnóstico  utilizadas por el  laboratorio, para establecer los diagnósticos diferenciales en casos con sintomatología similar y en casos especiales de diagnóstico. A largo de  esta presentación voy a mostrar casos y luego cómo se utilizan la diferentes técnicas de  laboratorio en el establecimiento de cada uno de los diagnósticos.

Aunque en este ejercicio se utilizarán casos clínicos de aves enfermas, el diagnóstico aviar también puede hacer en aves clínicamente sanas; por ejemplo conocer el nivel de anticuerpos en determinada enfermedad. No hay técnicas  para aves enfermas y técnicas para aves clínicamente sanas; es así que  si se busca el nivel de anticuerpos en un lote de aves clínicamente sanas, se tendrá que emplear  una técnica serológica y conocer ese nivel de anticuerpos, eso se incluye  como  diagnóstico. No necesariamente los diagnósticos están enfocados a  buscar agentes patógenos y cuando haya casos clínicos de enfermedad.

Bien sea que se parta de aves sanas o de aves clínicamente enfermas, el objetivo final de lo que se hace en un laboratorio es que el técnico encargado de una granja  arme su propio diagnóstico partiendo de los resultados que le da el laboratorio, dependiendo de las necesidades de cada caso: cultivo microbiológico/micótico/virológico, serología, histopatología, parasitología y biología molecular. En términos generales, el laboratorio emite resultados y el diagnóstico lo hace el técnico de campo quien conoce las otras partes que participan en el problema.

Entre la granja o las aves y el diagnóstico final hay una serie de etapas: la  observación o la inquietud que lleva a  consultar o enviar muestras al laboratorio, el llenado de la historia o protocolo de envío de muestras, la recepción de los resultados de laboratorio y finalmente el análisis de los mismos.

Gráfico No. 2. Secuencia desde el caso de campo (Aves enfermas - aves sanas) hasta la obtención del diagnóstico. Entre la granja, que desde luego es el lugar  donde encontramos las aves enfermas, y el laboratorio y los resultados emitidos por él, hay una serie de pasos que debemos observar detenidamente. Para que la elaboración del diagnóstico sea exitosa, es necesario que sepamos el contenido de cada una de las etapas que se muestran en la imagen. Qué tanto sabemos de cada una de  las etapas del proceso se puede establecer si logramos responder a las siguientes preguntas: 1) Que tan capacitados estamos en el diagnóstico presuntivo 2) Qué tanto sabemos y por lo tanto qué tan capacitados estamos en hacer una necropsia 3) Sabemos tomar las muestras en  una forma adecuada? 4) Sabemos el fundamento de cada una de las pruebas diagnósticas y por lo tanto en qué casos las podemos solicitar al laboratorio? 5) Estamos capacitados para "armar" el "rompecabezas" poniendo  los resultados juntos y emitiendo un diagnóstico?

Qué se solicita al laboratorio depende de qué tanto se sepa, tanto de las aves sanas como de las aves enfermas y del conocimiento del fundamento de las técnicas de laboratorio y finalmente de la interpretación de los resultados.

En primer lugar, se debe entender que  cuando se solicita el servicio del laboratorio de debe saber porqué: si son muestras de aves sanas, debemos saber qué es lo que se pretende conocer, por ejemplo los niveles de anticuerpos contra determinado agente patógeno como sucede con la respuesta a las vacunas. Si se trata de aves enfermas, hay un  punto de partida: a qué corresponde la sintomatología observada y adicionalmente qué más se puede esconder detrás de determinados síntomas.


Imagen No. 1 La gallina que se muestra en la fotografía de la izquierda presenta inflamación facial en el área correspondiente al seno infraorbitario. La tráquea cuyo aspecto macroscópico se presenta en la fotografía de la derecha es de esta misma ave. Probablemente el ave padece de infección con Avibacterium paragallinarum, pero el aspecto de la mucosa traqueal indica que amerita una evaluación histopatológica. La capacidad para elaborar un diagnóstico depende de qué tanta experiencia se tiene para descubrir qué hay detrás del aspecto macroscópico que caracteriza una entidad patológica. Los síntomas y lesiones de otra enfermedad pueden estar pueden estar enmascarados por la primera. Vienen dos preguntas al respecto cuando nos enfrentamos en este sentido a determinado cuadro clínico: 1) Qué hay aquí?  2) Qué más  puede haber aquí?

Viene luego el establecimiento del  contacto entre el técnico de campo y el laboratorio: la herramienta es el protocolo de envío demuestras o lo que es lo mismo, la elaboración de la historia. Este documento le permite al Médico Veterinario  quien atiende el caso en el laboratorio, entender de acuerdo con sus conocimientos pero sobretodo de acuerdo con su experiencia, qué procesos se deben  seguir internamente para  lograr resultados  que permitan  tener “claridad diagnóstica”.

En este  punto, se debe entender que  una sintomatología puede presentarse  debido a la acción de dos, y en algunos caso más de dos agentes etiológicos. Un ejemplo al respecto es la posición ortopneica que  tienen las aves  que sufren de laringotraqueitis viral: estiran la cabeza y respiran con el  pico abierto;  ocasionalmente emiten un ruido al  hemos llamado “pitido”. En ocasiones esta posición y la emisión del pitido puede deberse a otras entidades como la  bronquitis infecciosa; en lo personal he manejado varios casos.


Imagen No. 2. Dos aves  con posición ortopneica. Una de las habilidades que debe tener  quien observa las aves enfermas, es poder establecer un diagnóstico presuntivo, lo cual puede hacerse desde los síntomas mismos, de acuerdo con los cuales el primer diagnóstico para ambos casos es laringotraqueitis viral. Es el primer punto de partida para establecer cuales muestras se deben tomar y qué pruebas o técnicas de laboratorio se deben solicitar.

Las dos aves que se muestran en la  imagen presentan una posición ortopneica (Cuello estirado y pico entreabierto, en las imágenes no se observa pero dentro de los síntomas se incluyeron un ruido al que los Médicos Veterinarios llaman "pitido"). Es decir que por síntomas clínicos no se puede establecer de qué entidad se trata; de hecho podrían tener la misma enfermedad; en la realidad no es así. En este momento de debe entrar a escoger qué prueba se debe escoger o cual es el paso a seguir para establecer si hay diferencias;  si se procede a efectuar una necropsia y luego una evaluación histopatológica la cual revela las diferencias que se muestran en la imagen  siguiente.



Imagen No. 3:  la fotografía  de la izquierda corresponde a un corte de tráquea de la gallina de la izquierda (de color marrón) en la imagen 2 (anterior). Solo se observa la mucosa: presenta inflamación linfocítica de la lámina propia, el epitelio que inicialmente era pseudoestratificado cilíndrico ciliado ha cambiado adquiriendo un aspecto estratificado y las glándulas mucosas intraepiteliales se encuentran "atrapadas" dentro del proceso inflamatorio; no se observan cilias. Las lesiones no son patognomónicas, es necesario recurrir a otras pruebas diagnósticas en el lote de aves para definir de que enfermedad se trata: hay dos posibilidades, la primera es bronquitis infecciosa. A partir de este punto, hay que escoger más pruebas complementarias:  serología?,  PCR?,  Inmunoperoxidasa? Todo depende de la experiencia del profesional.

La fotografía de la derecha  corresponde a la mucosa de la tráquea de una de las aves de la imagen 2 (anterior,  gallina  de color blanco);  la mucosa presenta un estado inflamatorio por células mononucleares, se observa necrosis del epitelio con exfoliación de células y formación de células sincitiales las cuales  tienen cuerpos intranucleares de inclusión eosinofílicos; corresponde a un caso de laringotraqueitis viral; las células sincitiales conteniendo cuerpos intranucleares de inclusión son patognomónicas de laringotraqueitis viral.

Es en estos casos cuando el técnico debe saber que pruebas complementarias debe seguir; en la necropsia con frecuencia no encontramos lesiones que sean definitivas o que nos orienten.  Vienen entonces las opciones: histopatología, serología, intento de aislamiento viral y/o pruebas de  biología molecular. Para aplicar la serología como herramienta diagnóstica debemos saber las  ventajas y a la vez las limitaciones de la misma.

Con frecuencia el Médico Veterinario de campo no  tiene los suficientes elementos de juicio  para solicitar pruebas complementarias, es  entonces cuando las decisiones tomadas por el Médico Veterinario del Laboratorio deben entrar a jugar un papel definitivo en el tipo de pruebas o técnicas de laboratorio de deben usar para obtener un diagnóstico definitivo, que permita tomar acciones de campo, en el lote actual y aún en los lotes venideros.

Con frecuencia las necropsias se hacen en las granjas y el Médico Veterinario envía las muestras al laboratorio. Este debe estar entrenado en la toma, preparación, embalaje y envío de estas al laboratorio. Igualmente si son aves vivas: su envío requiere de unas condiciones mínimas tanto para que no fallezcan durante el viaje como  para que no sufran en el mismo y sus condiciones se agraven.


Imagen No.4. Una vez  que se tiene un diagnóstico presuntivo el cual se hace al evaluar las aves enfermas, se debe proceder a tomar  muestras para enviar al laboratorio de diagnóstico. La muestra pueden ser aves vivas, sangre sin anticoagulante (para obtener suero), tejidos para aislamiento viral, tejidos en formaldehido para evaluación histopatológica, hisopados, etc. Todo depende del diagnóstico presuntivo. En términos generales, la clase de muestra depende del primer paso que es la habilidad para reconocer la enfermedad por los síntomas y luego por las lesiones. Enviar animales vivos a los laboratorios de diagnostico depende de las legislaciones sanitarias que  rigen en los diferentes países. En Colombia, en la actualidad, es permitido enviar aves  vivas, desde luego enfermas, al laboratorio de diagnóstico.

La forma de envío del material objeto de diagnóstico depende de qué muestra se trate. En el caso de animales vivos, se deben procurar condiciones adecuadas con el objetivo de que lleguen vivas al laboratorio.
Una práctica muy común en nuestro medio, es el envío de muestras en formaldehido. Voy a hacer algunos enunciados respecto de esta práctica:
  • La histopatología tiene limitaciones y no siempre es definitiva en el  establecimiento de un diagnóstico.
  • Existe la tendencia, la cual hemos adquirido desde las Facultades de Medicina Veterinaria, de creer que las evaluaciones histopatológicas  son la mejor herramienta en el establecimiento de  un diagnóstico, sin atender a determinadas especificaciones o indicaciones.
  • Aunque existe el mejor ánimo en la mayoría de los casos, no siempre se envían los órganos adecuados, en la cantidad adecuada, con el medio de fijación adecuado y con la toma de muestras en el tiempo óptimo desde que se iniciaron los síntomas.

Imagen No. 5. El proceso de histopatología se puede comparar con una fotografía. Fragmentos de uno o varios órganos de un animal (Recientemente muerto) se incluyen en  una solución fijadora (Es este caso formaldehido 10% bufferado). La función del fijador es detener cualquier proceso de lisis o descomposición, las proteínas se  coagulan y todo queda estático como cuando se toma una fotografía. Mediante procesos posteriores, cortes de los órganos quedan listos para ser observados al microscopio. En resumen, podemos ver lo que estaba sucediendo en los órganos evaluados, cuando el animal murió. La proporción del volumen de la muestra con relación al fijador es de 1:9 (Fotografía de la derecha). Las tres primeras fotografías muestran un error que se  comete con frecuencia: se coloca demasiada cantidad de muestra con relación al volumen del fijador. Algunas superficies de los órganos que se ven de color rosa, significa  que el fijador no ha penetrado lo suficiente en  la muestra; esto se puede ver al cortar estos órganos mal fijados.


Imagen No. 6. Se debe ser consecuente en el envío de muestras. El remitente de estas muestras (Un Médico Veterinario) dice en el protocolo que las aves tienen síntomas respiratorios y que sospecha enfermedad de Gumboro. El envío de estas muestras tiene varias inconsistencias y errores: 1) Si las aves de donde proceden estas muestras tienen síntomas respiratorios, se debieron enviar traqueolaringes y pulmones. 2) Si el profesional sospecha que las aves tienen  enfermedad de Gumboro debió enviar suficientes bolsas de Fabricio (Solo envió 2)  3) El número de timos y de bazos debió ser concordante; adicionalmente, el número de órganos o fragmentos de órganos debe ser mínimo de 5  4)Evaluar hígado, aunque no tiene relación con lo que el Médico Veterinario sospecha, es válido siempre y cuando la cantidad de muestra sea adecuada. Enviar hígados completos evitó la fijación, seguramente la imagen al microscopio es de autolisis.


Imagen No. 7  Con frecuencia quienes envían muestras  para evaluaciones histopatológicas no están bien documentados acerca de la forma como se identifica la enfermedad en el laboratorio. Una consultora extranjera impartió instrucciones a un laboratorio cuya directora no tenía la formación académica de un Médico Veterinario. Seguramente copió mal el mensaje y comenzó a enviarme cabezas de aves en solución de formaldehido para que buscara cuerpos de inclusión de laringotraqueitis viral en el ganglio trigémino; inclusive me envía indicaciones con un gráfico acerca de cómo acceder al ganglio trigémino. Esto seguramente sucede, cuando quien accede a una técnica de diagnóstico, desconoce la enfermad y el proceso de diagnóstico. Quien dirige un laboratorio de diagnóstico aviar, debe ser un profesional Médico Veterinario, preferiblemente un Patólogo.
No se debe confiar la tomas de muestras  terceros; por lo menos hay que estar presente y dirigir el proceso. Hemos tenido casos en los que el Médico Veterinario le encarga al administrador de la granja (Por teléfono) que recoja unos animales y los envíe al laboratorio; esta persona, por desconocimiento no recoge las aves representativas del problema y terminaron recogiendo  los animales que se dejan atrapar fácil, los que suelen tener problemas de “cojeras” y que no son representativos de la sintomatología por la cual se recurre al laboratorio de diagnóstico.


Imagen No. 8. Las dos fotografías que  componen la imagen corresponden al caso descrito en el párrafo anterior. El Médico Veterinario indica al administrador de la granja que recoja unas aves y las envíe al laboratorio de diagnóstico. Según el protocolo de envío de muestras, dice que las aves de la granja presentan síntomas respiratorios, "cabeza hinchada". Como se explica en el  párrafo anterior, seguramente el administrador recogió las aves que se dejaron atrapar más fácilmente, las aves con problemas locomotores,  síntoma que  no era el que se pretendía investigar.
Aún los mismos  Veterinarios de campo dejan pasar el tiempo oportuno para enviar animales o sueros u otro tipo de muestras; dos ejemplos al respecto:
  • El envío de muestras de sangre cuando no es el tiempo oportuno (O muy temprano o muy tarde) para observar la respuesta inmunológica ante determinado evento, bien sea vacunal o infectivo.
  • El envío de muestras en formaldehido para evaluación histopatológica de laringotraqueitis cuando las células sincitiales que contienen los cuerpos de inclusión o no han aparecido o ya no están.
Imagen No. 9 Con frecuencia cuando se trata el tema de envío demuestras al laboratorio, se muestra lo que no se debe hacer. Los tubos de vidrio para enviar muestras de sangre al laboratorio están hechos de un material especial para tal fin. Reutilizar frascos en los que vienen empacadas las vacunas (Fotografía de la izquierda), menos si no están adecuadamente lavados y esterilizados (Fotografía del centro), no es adecuado. Igualmente no se deben enviar muestras de sangre en jeringas (Fotografía de la derecha), su extracción provoca hemólisis.
La elaboración de la historia o protocolo de remisión de muestras es importante porque es la conexión entre lo que sucede en la granja y lo que sucede en el laboratorio; así que la cantidad de información es importante, entre otras razones por las siguientes:
  • Orienta al Médico Veterinario del laboratorio o al analista acerca de la calidad de la muestra, la representatividad de la misma y de lo esperado en los resultados de conformidad con las técnicas aplicadas.
  • Permite disponer de una serie de datos con los que se puede hacer trazabilidad a la muestra y a los resultados. En los casos específicos de las serologías, son el punto departida para comparar el comportamiento de los lotes  y establecer “líneas  base” de los niveles de anticuerpos.
  • Son la base para estudios epidemiológicos.
Gráfico No. 3.  Protocolo de envío de muestras, primera parte.
Gráfico No. 4. Protocolo de envío de muestras, segunda parte. El protocolo de envío de muestras al laboratorio es el documento en el que queda consignado el contacto entre lo que sucede  en la granja donde se quiere hacer el diagnóstico y el laboratorio y el profesional quien hace los análisis. Es básico  para elaborar listados y tablas  a través de los cuales se puede  analizar la información y es la base para los informes y estudios epidemiológicos.

Ocasionalmente se reciben  aves en el laboratorio de diagnóstico, las cuales aunque no dan evidencia de una enfermedad infecciosa en cuanto a los síntomas, los protocolos indican que hay reducción en la producción de huevos; la investigación de la causa puede comprometer a agentes microbiológicos pero de acuerdo con nuestras observaciones, muchos casos suelen ser producto de parasitismos severos no detectados en las granjas. Aunque son casos  cuya etiología, en el caso de los parasitismos, es fácil de detectar, la ausencia de un profesional asistente técnico y/o la falta de experiencia y aún por negligencia, el diagnóstico oportuno  no se lleva  a cabo. Dos casos clásicos: parasitismo tanto por áscaris como por tenias al igual que parasitismos externos por “piojos”.


Gráfico No. 5. El protocolo de envío de muestras  es el registro escrito de lo que sucede en la granja; es por tanto el contacto entre la granja  y el  laboratorio de diagnóstico y de hecho entre la granja y el patólogo. Los responsables de la veracidad de la información son los Médicos Veterinarios encargados de las granjas. Esta responsabilidad no puede ser  confiada a los administradores de las granjas y en general a ninguna persona que no conozca la granja y que no tenga una formación académica para hacer que la información consignada en el protocolo sea de ayuda para orientar no  solo en el diagnóstico presuntivo sino también en la escogencia de la pruebas  complementaria y en el entendimiento de los hallazgos de necropsia y en general de laboratorio.

Existe la tendencia de considerar en términos generales que las causas infecciosas son las más importantes y prevalentes en las poblaciones avícolas. He manejado casos de diagnóstico en los que hay estados de parasitismo tan severos (Específicamente teniasis y ascaridiasis) que inducen la caída de la postura; con frecuencia los profesionales  responsables de la sanidad animal comienzan a buscar la causa en factores nutricionales  o en la presencia de infecciones como el caso del síndrome de caída de la postura, sin exámenes previos como  la necropsia. Es entonces cuando se  solicitan toda clase de análisis basados en la técnica de ELISA y en los que la teoría refiere que hay caída de la postura.

A veces en las historias o protocolos no encontramos la explicación para determinados estados clínicos, como por ejemplo en los casos externos de parasitismo intestinal en ponedoras los que las aves se ven aparentemente sanas pero baja notablemente el nivel de producción.


Imagen No. 10. La  parte superior de la imagen muestra parte del protocolo de envío de muestras. De acuerdo  con los síntomas reportados, el Médico Veterinario  asistente técnico no  realizó necropsias. Si lo hubiese hecho, habría  detectado el severo y masivo parasitismo de las aves por tenias, seguramente responsable de la sintomatología reportada. El caso demuestra que: 1) Antes de recurrir al laboratorio de diagnóstico, es necesario tener una apreciación acerca de lo que sucede con el estado sanitario de las aves  2) Que probablemente el asistente técnico de esta granja no asiste a ella con la suficiente periodicidad 3) Que con frecuencia, la sola necropsia da las pautas suficientes para tomar acciones correctivas, sin necesidad de recurrir al laboratorio. Debo aclarar que en las aves examinadas no se encontró lesión alguna relacionada con los síntomas respiratorios reportados.
Los protocolos o historias  son importantes porque además hay casos en que aunque la sintomatología es muy clara, por ejemplo cuando se presentan síntomas nerviosos estos se ven claramente,  la causa solo se visualiza cuando se practica la necropsia y se complementa con  histopatología y  pruebas de  biología molecular; a veces  no hay que llegar a  solicitar  esta últimas debido a que la causa se establece en el momento de la necropsia. En este punto entra en juego la experiencia de quien hace la necropsia: debe ser un Médico Veterinario quien la tenga.

Aquí hay que mencionar que es importante el envío de aves vivas al laboratorio no obstante que hay que guardar las medidas adecuadas para evitar la diseminación de un problema sanitario. La razón es que solo en sala de necropsias se pueden tomar algunas muestras  en las mejores condiciones para evitar la contaminación cruzada en el caso de técnicas microbiológicas y/o pruebas de biología molecular o  en el caso de tomar las muestras adecuadas de  órganos para una evaluación histopatológica  acorde con lo que pretendemos buscar en los tejidos.

Creo que hay casos específicos  en los que por tratarse de  eventos sanitarios especiales, como por ejemplo la sospecha de enfermedades exóticas o  el querer evitar la expansión de un problema sanitario en una región, no es conveniente movilizar aves enfermas.

Desconozco la reglamentación  en otros países al respecto del envío de aves vivas a los laboratorios; en Colombia no hay reglamentación respecto de movilizar aves vivas a los laboratorios de diagnóstico.


Respecto de las técnicas o pruebas de laboratorio, es importante que el Médico Veterinario de campo entienda el fundamento de las  pruebas, esto le permitirá a su vez entender los resultados. En entrenamientos de grupos de  profesionales de varias empresas he notado que:

  • El Médico Veterinario no sabe porqué exactamente solicita un prueba de laboratorio, como por ejemplo al técnica de  inhibición de la hemoaglutinación.
  • El Médico Veterinario desconoce las ventajas o desventajas de una técnica con relación a otra. Por ejemplo la ventaja de utilizar la técnica de inhibición de la hemoaglutinación sobre la técnica de ELISA en el caso de la detección de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Newcastle.
  • El Médico Veterinario  desconoce o no recuerda el tipo de inmunoglobulinas que detecta determinada técnica.
  •  El Médico Veterinario desconoce la sensibilidad y/o especificidad del la técnicas empleada.
  • El Médico Veterinario desconoce  el tipo de inmunidad (Celular y/o humoral) que despierta determinado agente patógeno e insiste en solicitar determinada prueba, la cual no es la indicada por las razones expuestas. Un caso clásico es cuando se solicita serología para laringotraqueitis viral, siendo que los expertos en el tema han socializado sobre las limitaciones de esta.
Imagen No. 11. Algunos clientes externos de los laboratorios  que prestan servicios de diagnóstico partiendo del examen de aves vivas que  son remitidas para tal fin, con frecuencia desconocen o al menos no conocen completamente la situación en la granja  de donde proceden las aves enfermas. Es entonces cuando al momento de recibir las aves, en los laboratorios se les exige llenar adecuadamente la información solicitada. Es claro como en este caso, que desconocen parcial o totalmente la información y tratan de solucionar la situación llamando a la granja para que les den la información requerida. Muchos de estos son  propietarios o profesionales independientes. Las empresas organizadas dan instrucciones precisas a sus técnicos para que elaboren protocolos completos, confiables, precisos claros en la información y en los exámenes que se solicitan al laboratorio.


Para saber qué tipo de técnica  o  prueba serológica utilizar en determinado momento tiene varios aspectos fundamentales que hay que conocer:
  1. Que existe un período de  inducción después de que un antígeno se pone en contacto con el organismo hasta que se inicia la respuesta inmunológica.
  2. Que la respuesta inmunológica por anticuerpos es en primer lugar de  inmunoglobulina IgM
  3. Que posteriormente la respuesta inmunológica cambia a IgG (IgY).
  4. Que es necesario saber qué tipo de anticuerpos detecta la técnica a utilizar.
  5. El nivel  de anticuerpos tiene que ver con el tipo de antígeno que entra en contacto con el organismo (Por ejemplo vacunas a virus vivo, vacunas oleosas, etc.)
  6. Cuál es la sensibilidad (Probabilidad de que un individuo enfermo de  un resultado positivo) y la especificidad (Probabilidad de que  un individuo sano  de  un resultado negativo) de la técnica empleada. En general no se conoce  ni la sensibilidad ni la especificidad de las técnicas serológica ELISA.

Imagen No. 12. Estos dos grupos de aves presentan síntomas nerviosos. De hecho hay que suponer que hay un daño en el sistema nervioso central. Estos casos presentan alerta entre los profesionales encargados de la sanidad en las granjas y entre los profesionales de la entidad del Estado que maneja la sanidad animal. Entre las enfermedades que pueden inducir esta serie de síntomas están la enfermedad de Newcastle y la influenza aviar. En Colombia hemos detectado algunas enfermedades de etiología bacterial las  cuales  pueden causar otitis media e interna u  osteítis craneal con encefalitis purulenta, estas causan síntomas  similares a los producidos por enfermedades virales como las citadas anteriormente.

En este punto es definitiva la experiencia del profesional de campo en el reconocimiento de síntomas y lesiones ocasionados por  enfermedades  que cursan con síntomas nerviosos al igual que el las pruebas diagnósticas que debe usar para llegar a un diagnóstico definitivo. Además de las lesiones a la necropsia se deberá recurrir a la evaluación histopatológica como herramienta diagnóstica, probablemente a una serología como la inhibición de la hemoaglutinación  y posteriomente técnicas de biología  molecular.


Imagen No. 13 Cuando se presentan síntomas nerviosos y no hay evidencia macroscópica de lesión inflamatoria bacterial, la histopatología es una herramienta diagnóstica de  primera instancia para establecer si hay daño en el sistema nervioso central que tipifique una infección viral. La fotografía de la izquierda  muestra  un área de gliosis focal, a la derecha se observa inflamación no purulenta de las meninges, se presenta vasculitis e infiltración perivascular de linfocitos. Esta lesiones corresponden a enfermedad de Newcastle y se observaron en los pollode de la fotografía de la izquierda de la imagen No. 11 (Anterior).



Imagen No. 14 Cuando se presentan síntomas nerviosos como los que se observan en la imagen No. 11   (Derecha) y la evidencia macroscópica es de una inflamación purulenta (Como lo muestran las fotografías de la derecha y del centro), esto explicaría los síntomas como los que muestran las aves de la derecha de la imagen No. 11. No obstante la evaluación histopatológica debe  confirmar esto (Fotografía de la derecha, en la cual se observa inflamación purulenta de meninges, Hematoxilina-Eosina 40X). 

Igualmente es  necesario saber en cuál edad del ave se  usa la técnica para la detección de anticuerpos
  1. En  aproximadamente las dos primeras semanas, las técnicas serológicas detectan la presencia de anticuerpos heredados de la madre (Inmunidad materna).
  2. Posteriormente las técnicas serológicas se emplean para medir la respuesta a las vacunas y/o la respuesta al contacto con  antígenos de campo.
Es por tanto importante entender el fundamento de las técnicas serológicas más frecuentes, para saber cuando es conveniente utilizarlas e igualmente cómo se interpretan los reportes del laboratorio. veamos lo referente a la técnica de inhibición de la hemoaglutinación.

Algunos virus tienen en su envoltura glicoproteinas llamadas hemaglutininas las cuales tienen la capacidad de unirse a glóbulos  rojos de determinadas especies. Esta propiedad se denomina hemoaglutinación. En un sistema que tenga una suspensión de glóbulos rojos y virus hemaglutinantes, estos forman una "red" que impide que los  glóbulos rojos  se sedimenten. El fenómeno se denomina hemoaglutinación (HA) y sirve para medir la cantidad de virus que tiene un líquido, como por ejemplo el líquido alantoideo de los huevos donde se ha cultivado. Cultivar material biológico (Encéfalo por ejemplo) de aves sospechosas de padecer enfermedad de Newcastle y luego aplicarle a este líquido la técnica de HA, es una forma de saber si el virus está presente y medir la cantidad de virus (Desde luego, cuando el aislamiento es positivo).

En un sistema líquido en el que se coloca un suero que tiene anticuerpos contra un virus hemaglutinante, un virus que hemaglutina y glóbulos rojos susceptibles a la hemoaglutinación, los anticuerpos reaccionan con el virus y "bloquean" las hemaglutininas, estas ya no pueden aglutinar los glóbulos rojos: esto se denomina "inhibición de la hemoaglutinación" (HI). Estas propiedades se utilizan para saber la cantidad de anticuerpos  contra virus hemoaglutinantes que tiene un suero, haciendo diluciones progresivas, lo cual se denomina titulación de anticuerpos.

Gráfico No. 6. Hemoaglutinación e inhibición de la hemoaglutinación. El esquema de la izquierda muestra las hemaglutininas virales que pueden reacionar con la membranas de glóbulos rojos de algunas especies formando una "red" que en un sistema en el que estos dos  componentes se encuentran, impiden  que los glóbulos rojos se sedimenten; esto corresponde a la hemoaglutinación. En el esquema de la derecha se representa un sistema que tiene tres componentes: el virus, los anticuerpos que reaccionan con las hemaglutininas y los glóbulos  rojos. Las hemaglutininas reaccionan con lo anticuerpos (Que indujeron su formación), lo que impide que los glóbulos rojos reaccionen con estas; este fenómeno se denomina inhibición de la hemoaglutinación y es una propiedad que se usa para medir las cantidades (Niveles de anticuerpos) en un sistema en que el suero se diluye progresivamente. 

Veamos ahora aspectos referentes a la técnica ELISA:

La técnica  ELISA o ensayo por inmunoabsorción ligado a  enzimas, es básicamente es una técnica colorimétrica en la que los anticuerpos contenidos en el suero reaccionan con el antígeno o fracciones de él colocados en los pozos que contienen las placas sobre las que se monta la técnica. La técnica está diseñada para que la reacción antígeno-anticuerpo  desarrolle color, el que es medible por la cantidad de luz que deje pasar (Tramitancia) relacionada con la cantidad de luz que el complejo absorbe (Absorbancia). La cantidad de color y por tanto la tramitancia y la absorbancia están dadas por la cantidad de anticuerpos contenidos en el suero.


Gráfico No. 7.  Técnica ELISA (Indirecta).  En las figuras se representa esquemáticamente la técnica de ELISA indirecta (Para bronquitis infecciosa) mediante la cual se detectan anticuerpos contra el virus de bronquitis. En el fondo de los pozos de la placa (96) va "pegado" un antígeno; en estos pozos  se colocan los sueros "problema"; si los anticuerpos son homólogos con el antígeno, se provoca una reacción con un conjugado (Antianticuerpo) el cual tiene una enzima que actúa con un sustrato para desarrollar color. La cantidad de color es proporcional a la cantidad de anticuerpos. En un equipo se  mide la intensidad del color, el cual es proporcional a la cantidad de anticuerpo.

En la derecha de la gráfica  No. 7 está la tira que emite el equipo donde se "lee"  el preparado. El equipo lo que hace es medir las densidades ópticas, luego calcula la relación s/p o coeficiente muestra positivo (Que es un factor de corrección). El título (Ó cantidad de anticuerpo) se calcula mediante una ecuación que implica el coeficiente muestra positivo. El punto de corte nos dice a partir de cuál  relación s/p, una muestra es positiva. 

El concepto de "muestra positiva" es solo en teoría, pues sabemos que la positividad es un concepto que varía de acuerdo con diversas condiciones: edad del ave, estado inmunológico, tipo de vacuna empleada, etc. En la gráfica de la derecha, por ejemplo, el impreso arrojado por el equipo dice que   a partir de 0.239 en la relación s/p (Que corresponde a un título de 481), la muestra es positiva. Sabemos, en nuestro medio (Colombia), que 481 no significa nada en términos de anticuerpos contra el virus de bronquitis. La positividad o negatividad y su significado están explicado en el texto de este artículo.

La técnica en términos teóricos es muy sensible y muy específica pero estos datos no los suministran las casas comerciales que los producen, así que uno no sabe qué tan positivo está un enfermo o que tan negativo está un animal  cuyo suero sanguíneo se sometió a la  prueba.

Un segundo aspecto a considerar en la técnica  ELISA es que los antígenos pegados a las placas deben ser homólogos con los virus actuantes tanto en vacunas como  en campo. A menos que haya reacción cruzada,  un caso  clínico de campo o un ave vacunada  pueden ser  negativos en la prueba  o no detectarse títulos elevados.

Esto llegó a demostrarse (A comienzos de la década de 1990) en los casos de enfermedad de Gumboro en la que debido a la variabilidad del virus, se podía tener casos clínicos positivos, igualmente positivos por histopatología,  pero con serología  negativa o con  niveles muy bajos. Esto lo remediaron después del año 2.000 las casas comerciales, produciendo  kits para la detección serológica de la enfermedad de  Gumboro, que ellos llamaron  “de rango ampliado”. Habían modificado el antígeno en las placas de tal manera que detectara serológicamente las nuevas  cepas del virus.

La técnica de ELISA tiene variantes,   que no vamos a considerar individualmente en esta ponencia.

Para la interpretación de los resultados de la técnica de ELISA, es  bueno no solamente saber el fundamento, la sensibilidad y la especificidad, la edad de las aves, el tipo de vacuna. Se requiere conocer qué significa el término coeficiente de variación  (Obtenido  con base en la media y la desviación estándar) nos permitirá saber que tan buena o no  es la dispersión de los títulos de anticuerpos  y hacer inferencias a partir de estos datos.


Gráfico No. 8. Coeficiente de variación. "Montar" una prueba de ELISA y mirar el impreso o evaluar los títulos no tiene significancia si  no se hace una "evaluación" estadística sobre cómo es la distribución de los títulos frente a una medida de tendencia central. Este parámetro es el coeficiente de variación, el cual compara la desviación estándar contra la media de los títulos. El coeficiente de variación es una medida  útil en el sentido de que compara dos escalas distintas las cuales están relacionadas con un factor común. El coeficiente de variación mide la uniformidad de los títulos de los anticuerpos detectados. Es un excelente parámetro para determinar por ejemplo la efectividad de un programa de vacunación. Nos indica la uniformidad de un proceso de inmunización. Permite evidenciar cuándo los títulos se salen de determinados parámetros considerados "normales". Sirve par decir que un lote de aves "es serologicamente positivo". Un coeficiente de variación menor de 30%  se considera excelente;  de 31 a 50% bueno;  de 51 a 80% regular y mayor de 90% pobre.

En relación con esta técnica, se deben saber  datos que no son  inherentes a la prueba en sí. Es necesario saber cual es el comportamiento de los niveles de anticuerpos en la granja, en la región, en las granjas de la empresa. Me refiero a las líneas base. En resumen: no basta tener unos datos sobre niveles de anticuerpos. Es necesario saber qué significan con respecto a la granja, a la empresa y a la región.

Al respecto de pueden citar los siguientes ítems:
  • ELISA es una técnica valiosa para observar las tendencias de seroconversión, ante desafío de campo o vacunales
  •  Las variaciones  significativas en cuanto a desafíos de campo o vacunales se pueden detectar con el uso de la técnica. Para ello se requiere usar sueros pareados, es decir dos muestreos con un intervalo entre ellos para saber si hay seroconversión.
  • En este sentido se puede usar para medir la respuesta a vacunas.
  • La técnica ELISA no determina o detecta repuestas inmunológicas contra  cepas específicas o variantes. El ejemplo es que ELISA no puede determinar si las aves  con problemas de bronquitis fueron desafiadas con una de los serotipos como Massachusetts, Arkansas, DEO72, Connecticut u otros.
  • En términos generales, la técnica no es específica. En este sentido se puede usar para detectar la ausencia de infección.
  • La técnica no se debe usar para detectar protección contra agentes patógenos; hay que considerar las circunstancias epidemiológicas  de la región donde está(n) la(s) granja(s) evaluada(s). 
Una de las técnicas de diagnóstico más utilizadas es la histopatología. El uso de  la histopatología se viene incrementando en forma indiscriminada. En lo personal tengo varias hipótesis acerca  de por qué sucede esto:
  •  Porque se desconocen los alcances y las limitaciones de la técnica.
  •  Porque en las facultades de Medicina Veterinaria  nos han enseñado la histopatología con un sobredimensionamiento de los alcances de la  misma en cuanto que sea una técnica de diagnóstico.
  • Como consecuencia, muchos de nuestros técnicos no pueden establecer un enlace entre lo que están viendo en los casos de campo  y cuándo la histopatología puede serles útil.  En este sentido, las histopatología se usa más para descartar que para confirmar una etiología.
  • Lo anterior tiene que ver  con la falta de experiencia, no en todos los casos, para identificar clínicamente un caso de campo. Al respecto voy a presentar  dos casos clínicos en los que en uno de ellos es definitiva la histopatología, mientras que en el otro, el diagnóstico definitivo se puede hacer en la necropsia.


Imagen No. 15.  Se aprecian dos grupos de  aves cuya sintomatología es similar: postración y estiramiento de extremidades. Es una ejemplo de cómo el proceso de elaboración de un diagnóstico tiene un vía regular en la que se debe comenzar por asociar los síntomas con una probable etiología y desde luego con lo que esperamos encontrar en las lesiones y de cuándo se  pueden solicitar determinadas pruebas complementarias, específicamente la evaluación histopatológica. Las aves de la izquierda tienen 16  semanas y son remitidas con una historia de "Postración". Las aves de la derecha tienen igualmente 16 semanas y viene remitidas con una historia de "cojeras". De hecho el siguiente paso, después de revisar la historia, es proceder a una necropsia para determinar si se requieren pruebas complementarias y cuáles en el caso de  que estas se requieran.


Imagen No. 16. El aspecto macroscópico al realizar la necropsia en los casos que se presentan en la imagen anterior (14), da las  pautas para escoger o no  pruebas complementarias. Las fotografías de la izquierda muestran un nervio ciático con engrosamiento, aspecto edematoso y pérdida de estrías (Corresponde a una de las aves de la izquierda de la imagen anterior), de acuerdo con esto, el caso por clínica y lesiones macroscópicas corresponde a enfermedad de Marek: prueba complementaria inmediata: evaluación histopatológica. La fotografía inferior izquierda muestra la infiltración del nervio ciático por células linfoides, propio de la enfermedad de Marek.



El aspecto macroscópico de los órganos y tejidos que se muestran en las cuatro fotografías de la derecha (Que corresponden a las aves de la derecha en la imagen anterior (No. 14) y en las cuales se observan uratos) corresponde a un caso de gota (Visceral y articular). En la práctica no requiere pruebas  complementarias en el sentido de que la identificación macroscópica es suficiente para emitir un diagnóstico de gota.
El uso de la histopatología tiene ventajas y restricciones cuyo conocimiento es de uso exclusivo para el histopatólogo por su formación académica, pero este está en el deber de socializar sobre la utilidad y las ventajas o desventajas de la técnica.

En este sentido, he publicado dos artículos  en el blog “Patología aviar mi diagnóstico” sobre la enfermedad de Gumboro en relación con las vacunas y las  vacunaciones. Al respecto, la hipótesis que tengo luego de evaluar  muchos casos en aves en diferentes estados productivos, es que algunas de las vacunas pueden afectar la bolsa de Fabricio a tal punto que las lesiones de depleción linfoide y atrofia pueden  ser atribuibles tanto a un virus de campo pero igualmente pueden ser ocasionados por ciertas vacunas.

Con base en lo anterior, las evaluaciones histopatológicas de la bolsa no siempre son concluyentes respecto de si se trata o no de la enfermedad de Gumboro. En contraposición con esto, vale la pena  citar el trabajo del  doctor Juan Carlos Valladares, Médico Veterinario Zootecnista, Maestro en Ciencias en Microbiología  presentó en la tercera reunión de la Asociación de Especialistas en Ciencias Avícolas del Centro de México en marzo de 2010, un trabajo titulado  "Experiencias prácticas en el diagnóstico de la bolsa de Fabricio". Se puede acceder al documento mediante el siguiente enlace:

http://www.engormix.com/MA-avicultura/sanidad/articulos/experiencias-practicas-diagnostico-infeccion-t2904/165-p0.htm

Es un  excelente trabajo sobre la infección de la bolsa con el virus de Gumboro en el cual se contemplan los aspectos teóricos sobre el agente etiológico y sobre los aspectos clínicos de la enfermedad. Es un trabajo interesante en el que mediante estudios histopatológicos, se desarrolló un sistema de evaluación de las lesiones microscópicas de la bolsa basado en cuatro criterios:
  1. Tipo y curso de la lesión: afectación de la densidad celular, daño de la integridad del tejido linfoide, inflamación del tejido de la bolsa.
  2. Distribución de la lesión: focal, multifocal,  extensiva o difusa.
Creo que es un trabajo muy objetivo que permite una cuantificación de las lesiones y es el primer trabajo que veo  el cual organiza en forma adecuada el aspecto morfológico de las bolsas evaluadas de tal manera que le da a la evaluación histopatológica la importancia que se merece.

Se presentarán casos  de la enfermedad de Gumboro y de lesiones atróficas  a lo largo de la intervención.

Las técnicas de laboratorio más difundidas y de mayor uso en la última década, son las técnicas de biología molecular, especialmente la técnica  de PCR y sus aplicaciones. Las veces que he  efectuado  talleres como el que es objeto de este escrito, he hecho una evaluación preliminar sobre los conocimientos acerca de los fundamentos de las técnicas de biología molecular, específicamente de PCR y la verdad sea dicha, en los grupos de técnicos con los que he trabajado, lo conocimientos acerca del tema  no son lo suficientes como para entender la aplicabilidad y los alcances de la técnica o de las técnicas.


Gráfico No. 9. Mediante las técnicas de biología molecular, los marcadores moleculares compuestos por secuencias de nucleótidos (Que identifican un organismo) se pueden amplificar, copiar, marcar, someter a digestión con enzimas de restricción y posteriormente la longitud de los fragmentos puede ser caracterizada y comparada contra un banco genómico en el que  están contenidos y caracterizados los fragmentos de restricción de diferentes microorganismos. El cuadro que se muestra en la parte inferor derecha es tomado  de uno de los trabajos del Dr. Alejandro Banda, del Laboratorio de Investigaciones y Diagnóstico en Avicultura, del Colegio de Medicina Veterinaria de la Universidad estatal de Mississippi E.U., quien ha tipificado el virus de la enfermedad de Gumboro en diferentes países de América mediante esta técnica.

Y es que la culpa, al menos en parte, la tienen o la tenemos en parte los técnicos de laboratorio por no socializar sobre los fundamentos y los alcances y las limitaciones de las mismas.


Imagen No. 17. El corte de bolsa de Fabricio (De aspecto histológico normal) que se muestra a la izquierda corresponde al órgano al que se le hizo impresión en tarjeta FTA y se remitió al un laboratorio para investigación del virus de enfermedad de Gumboro mediante PCR. A la derecha está el resultado.

Existe la tendencia “esnobista” entre muchos técnicos y avicultores de avanzada de creer que porque se utilizó PCR en la investigación de un problema sanitario, la respuesta obtenida es la definitiva. Y es que yo he escuchado frases como esta. “Es que yo tengo  anemia infecciosa porque en mi granja me la diagnosticaron por PCR”; estoy seguro de que este profesional solo sabe que PCR quiere decir  “reacción en cadena de la polimerasa”, pero nada más.

DISCUSION Y CONCLUSIONES

Para quienes estamos viendo las aves enfermas, las lesiones a la necropsia, el estado de los  órganos y tejidos al microscopio, el resultado de los cultivos microbiológicos y en algunos casos las pruebas de biología molecular, el panorama es diferente. Puedo presentar  casos en los cuales tengo imágenes de los folículos  de  bolsas de Fabricio  100% histológicamente normales, serologías  con niveles de anticuerpos relativamente bajos  en relación con la zona donde está ubicada la granja, con reportes de RT-PCR positivos  para el virus de Gumboro. No se puede decir que ese es un caso de enfermedad de Gumboro, pero igualmente no se puede afirmar que el virus de campo no está allí.

Este es solo un caso que nos permite concluir que el uso exitoso de una técnica  debe comprender  muchas circunstancias relacionadas con el caso clínico, la toma de la muestra, la contaminación cruzada de la misma y otros asuntos más entre los que están la falta de complementación con otras técnicas de biología molecular como la de RFLPs o polimorfismo en la longitud de los  fragmentos de restricción.

Durante esta intervención, se presentan casos en diferentes estados productivos; estos casos tienen sintomatología similar, pero con lesiones macroscópicas diferentes. Con el ejercicio lo que se pretende es interactuar  con los técnicos participantes para discutir  con ellos sobre:
  • El diagnóstico  de acuerdo con los síntomas.
  • El diagnóstico de acuerdo con las lesiones
  • Qué o cuáles técnicas o pruebas complementarias se utilizarían para llegar al diagnóstico o a los diagnósticos definitivos.
  •  La utilidad y la aplicabilidad de las técnicas de posible aplicación en cada caso

LITERATURA CONSULTADA

1.    Quemaduras con ácido; mal envío de muestras.
2.    Enfermedad de Gumboro: depleción linfoide y lesiones atróficas, pueden ser inducidas por las vacunas?
3.    Enfermedad de Gumboro, casos, Fallan las vacunas o fallan las vacunaciones?
4.    Antracosis. Las aves comerciales, un indicador biológico?
5.    Síndrome de “cabeza hinchada”. Tratamiento con solución yodada.
6.    Varus y valgus. Deformación de la articulación intertarsal. Manejo? Genética?
7.    Salmonelosis en las aves. Pulorosis y tifoidea aviar.
8.    Espondilolistesis
9.    Síntomas nerviosos en aves. Encefalitis y otitis bacterial como responsables
10.  Ruptura del tendón del gastrocnemio
11.  Listeria monocytogenes
12.  Ornithobacterium rhinotracheale
13.  Campylobacter
14.  Ascaridiasis
15.  Hígado graso hemorrágico
16.  Dedos torcidos
17.  Celulitis
18.  Infecciones con Staphylococcus
19.  Vacunas intramusculares. Miopatía pectoral postvacunal.
20.  Coliformes. Qué son? Qué representan?
21.  Amoníaco como probable causante de cabeza hinchada.
22.  Micotoxicosis en aves. Toxinas dermonecróticas
23.  Artritis viral
24.  Enteritis necrótica
25.  Buche penduloso
26.  Leucosis aviares
27.  Rotación de la tibia
28.  Mycoplasma gallisepticum
29.  Mycoplasma synoviae
30.  Mal emplume
31.  Encefalomalacia
32.  Erosiones en la capa córnea de la molleja
33.  Avibacterium paragallinarum
34.  Viruela aviar
35.  Osteoartritis vertebral
36.  Fatiga o parálisis de jaula.
37.  Traqueítis. Cuándo tienen carácter diagnóstico.
38.  Gota
39.  Hepatitis con cuerpos de inclusión/hidropericardio
40.  Cryptosporidiosis aviar
41.  Neuropatía periférica
42.  Marek, una enfermedad, a veces un litigio.
43.  Enfermedad de Newcastle
44.  Osteocondrosis
45.  Síndrome de cabeza hinchada
46.  Colibacilosis aviar
47.  Coccidiosis aviar
48.  Enfermedad de Gumboro
49.  Discondroplasia de  la tibia
50.  Micosis pulmonares
51.  Laringotraqueitis viral