Fotografías e imágenes: Bernardo Mejía Arango, M.V.Z. M.Sc. Protegidas por derechos de autor. Su uso o reproducción deberá contar con autorización previa.
La afirmación anterior sobre la especificidad de la técnica, genera en un momento determinado una serie de controversias sobre las cuales no se menciona casi nada por las siguientes razones:
- Porque los Médicos Veterinarios que la emplean no conocen el fundamento de la técnica.
- Porque las casas comerciales no lo dicen o informan en sus insertos. Estos datos son parte del "dosier" de cada compañía.
- Porque las casas comerciales incluyen en sus insertos unos datos sobre positividad de las muestras (En condiciones de laboratorio para obtener controles positivos para la técnica) que no corresponden a lo que realmente sucede en el campo.
Emplear la técnica serológica ELISA en el diagnóstico aviar tiene varias implicaciones y se puede usar con diferentes fines.
La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la enfermedad.
ESPECIFICIDAD: es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo.
En otras palabras, se puede definir la especificidad como la capacidad de un test para detectar a los sanos.
Figura No. 1 La conformación de los determinantes antigénicos o epítopos (Epítopes) que son las macromoléculas que son reconocidas por el sistema inmunitario son las que finalmente determinan la característica del anticuerpo que el sistema inmunológico y que un organismo sintetiza como respuesta a la agresión por parte de una agente etiológico, en este caso un virus. En este sentido, antígeno y el anticuerpo que se forma a partir de él, son complementarios para que la respuesta inmunológica sea exitosa. Esta propiedad es llevada a las placas del sistema ELISA en condiciones de laboratorio para producir una serie de reacciones que finalmente generan un color que es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo y que debe ser inmunologicamente complementario para que esta reacción se produzca. El color y por tanto la cantidad de anticuerpo se mide en un espectrocolorímetro. En la figura, los anticuerpos IgY de las aves (Mal llamados IgG como los de los mamíferos) deberan ser específicos con relación al agente (Virus en este caso) que indujo su formación. Igual que lo que sucede en el sistema inmunitario de las aves, se produce en las placas ELISA. |
(El concepto de especificidad es igualmente aplicable en el sentido de que en la técnica, el antígeno de las placas es capaz de reaccionar con anticuerpos cuya formación se indujo por un epítope de un agente etiológico y no en otros del mismo tipo de virus que puede tener variaciones (en los epítopes) de su fracción antigénica (Lo que genera nuevos variantes dentro de un serotipo).
En otras palabras, ELISA es específica en la medida en que sea capaz de detectar anticuerpos contra sectores muy específicos de fracciones antigénicas de agentes etiológicos (En este caso de virus) que comparten características en estas fracciones antigénicas. Es el caso del virus de la enfermedad de Gumboro: las técnicas pierden especificidad en la medida en que el virus de campo evoluciona y genera variaciones en la proteína VP2.
- Que un animal positivo (En el test) esté enfermo, es decir es un verdadero positivo.
- Que un animal positivo (En el test) esté sano, es decir es un falso positivo.
- Que un animal negativo (En el test) este enfermo, es decir es un falso negativo.
- Que un animal negativo (En el test) esté sano, es decir es un verdadero negativo.
ELISA es tenida como técnica serológica en avicultura y como una herramienta valiosa:
- Como referencia para tendencias de seroconversión en una empresa avícola con desafíos de campo.
- Para identificación de seroconversión rápida en muestras duplicadas (Pareadas) de animales enfermos y convalecientes en una situación diagnóstica.
- Para evaluación de vacunas y procedimientos de aplicación de vacunas.
- Para tener claridad diagnóstica: por ejemplo cuando dos grupos de aves tienen sintomatología similares pero etiologías diferentes.
- Para documentar la ausencia de anticuerpos contra los agentes patógenos como el virus de la gripe aviar, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae.
- El el fondo del pozuelo va pegado un antígeno; el kit comercial ya viene preparado con placas que tienen en el fondo de los pozuelos determinados antígenos (Virus o partículas virales) dependiendo de la enfermedad y agente actuante y de los anticuerpos que este despierta en el organismo afectado que es lo que se quiera evaluar.
- Se agrega suero diluido de las aves que se van a analizar. Si estas aves fueron desafiadas por un antígeno (vacunal o virus de campo) y si tienen anticuerpos homólogos para el virus que indujo su síntesis y este virus es igual al que está pegado en el fondo de los pozuelos, se produce una reacción antígeno anticuerpo.
- La reacción antígeno-anticuerpo se puede visualizar adicionando un anti-anticuerpo que va marcado con una enzima. Este producto anti-anticuerpo marcado con una enzima se denomina conjugado. El conjugado es específico de especie. No se puede utilizar una técnica que tenga conjugado anti-pollo en otro género y especie diferente.
- La enzima que tiene el conjugado es capaz de reaccionar con un sustrato que se adiciona a los pozos después de haberse adicionado el conjugado.
- Si el los anticuerpos que contiene el suero son homólogos con el antígeno que traen las placas, el conjugado y por tanto la enzima es capaz de actuar sobre el sustrato generando un color en los pozuelos.
- El color que se desarrolla es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en el suero.
- Si los anticuerpos que tiene el suero del ave no son específicos contra el antígeno que va pegado en el fondo de los pozos, no se produce la cadena de evento que finalmente termina desarrollando color como se explicó hasta el paso anterior, no se produce color y como no hay color, no hay nada que medir o en sentido exacto la medición da resultados negativos.
Figura No. 5: esquematización de lo que sucede en uno de los pozuelos de una placa ELISA. |
* El instructivo de cada técnica no dice contra que serotipo de virus, porque no explica cuál antígeno está pegado en el fondo de los pozos de cada placas. Así que estos valores de referencia, son para un virus o la variante de un virus sobre el cual no tenemos información.
Una vez que se tiene la relación s/p, continúan los cálculos para obtener el título (Cantidad) de anticuerpos en las diferentes muestras, lo cual se hace mediante la siguiente fórmula:
Existen varias interpretaciones acerca de los títulos considerados como positivos en las diferentes explotaciones aviares en las que se usa ELISA como la técnica de diagnostico serológico. Quizá las enfermedades que más controversia pueden crear en cuanto a los resultados y en cuanto a la aplicabilidad de los mismos, son: bronquitis infecciosa aviar y enfermedad de Gumboro. Son dos de las enfermedades con las que más contacto tengo como patólogo.
No se pueden extrapolar los datos de una granja a otra ni de un tipo de explotación a otro. Lo que en una granja o tipo de explotación es positivo, en otra puede que no lo sea.
Del doctor Jorge Alberto Escamilla Juarez, del Laboratorio Cordobés de Diagnóstico Pecuario S.A. se pueden citar las siguientes referencias:
Bronquitis Infecciosa: La prueba más utilizada es la ELISA, la presencia de anticuerpos maternos en pollitos de un día de edad indican protección. Pollos de engorda con un vacuna de virus vivo se esperan títulos de 500 a 2500. Aves de postura o reproductoras con 2 o 3 virus vivos se pueden obtener títulos de 10,000 o mayores.
Infección de la Bolsa de Fabricio: la prueba más utilizada es la ELISA. Anticuerpos maternos en pollitos de un día indican protección. En pollo de engorda con 1 a 2 vacunas a virus vivo se esperan títulos entre 500 a 2500 a la 5 semana de edad. En aves con vacunas emulsionadas se pueden tener títulos entre 5000 a 20,000.
http://www.lcdp.com.mx/publicaciones/resultados.pdf
Personalmente creo que esto sucede o se puede tener como cierto si los anticuerpos que tienen circulantes las aves son homólogos con respecto al virus o a la fracción del virus que está pegado en los pozos de las placas ELISA, es decir si son específicos.
El Doctor Gwenllyan Slacum de la compañía BioCheck USA Corp. tiene en la Revista MB Editores del 30 de mayo de 2014, una publicación sobre "El uso de la prueba de ELISA para Detectar Anticuerpos" El Dr. Gwenllyan midió en pollos de engorde vacunados in ovo a los 18 días de incubación y/o subcutáneamente al día de edad con diferentes vacunas recombinantes en herpesvirus de pavo (HVT) conteniendo genes para las proteínas inmunogénicas de los virus de la enfermedad de Newcastle, laringotraqueitis infecciosa y enfermedad de Gumboro. Luego midieron a diferentes intervalos los niveles de anticuerpos.
Dice en su artículo el Dr. Gwenllyan, que el título promedio típico de anticuerpos contra el virus de Gumboro después de la vacunación en las condiciones mencionadas antes, tuvo un rango de 500 a 3.000 con una serovonversión de 80%, 35 días después de la vacunación. Después de desafiar las aves con un virus virulento, los títulos se incrementaron 6 veces en aves debidamente vacunadas y 12 veces en aves susceptibles (No vacunadas?).
http://bmeditores.mx/el-uso-de-la-prueba-de-elisa-de-biochek-para-detectar-anticuerpos/
Estos resultados indican que el antígeno pegado en los pozuelos de las placas de ELISA era homólogo respecto de los anticuerpos. El virus de la enfermedad de Gumboro es un virus variante que en el tiempo y si las pruebas de ELISA no tienen un antígeno homólogo con relación al virus actuante en el campo, la detección va a tener niveles o cifras bajas que se interpretarán como negativas cuando en realidad pueden no serlo.
Esto comenzó a suceder cuando a principios de la década de 1990 (Al menos en el suroccidente de Colombia), en muchos casos cuando en la evaluación histopatológica las lesiones eran de enfermedad de Gumboro, las serología de esta aves tenían perfiles muy bajos o eran negativas. El virus estaba variando y ya no era detectado por las técnica ELISA. Debido a que esto ha sucedido paulatinamente en el tiempo, las casas comerciales se han dado cuenta de ello y cuando se les menciona la situación, sus representantes dicen que han cambiado los antígenos en los pozos y que hay una especie de antígeno múltiple, lo que ellos llaman "de rango ampliado"; igualmente no dan información específica acerca del antígeno en esas placas.
Encontré una publicación hecha por profesionales del Grupo de Investigación en Microbiología y Epidemiología de la Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, en la cual utilizaron la técnica ELISA en un estudio de comportamiento del virus de bronquitis infecciosa en pollo con sintomatología respiratoria. Citan de manera general los siguientes títulos de anticuerpos como parámetros de interpretación de los resultados:
- Aves sin vacunación con títulos superiores a 690 son considerados de exposición positiva al virus de la bronquitis infecciosa aviar.
- Aves con vacunación se considera con exposición positiva cuando sus títulos son mayores a 2.000
El Doctor Guillermo Zavala del Georgia Poultry Laboratory Network tiene una publicación muy interesante sobre la interpretación y aplicabilidad de los exámenes serológicos en condiciones de campo, se puede acceder al artículo mediante el siguiente enlace:
http://www.microclin.com/archivos/interpretacion_de_examenes_serologicos_en_campo_Dr_G_Zavala.pdf
En dicha publicación menciona aspectos importantes cuando se hacen estudios serológicos: edades estratégicas, estacionalidad para el muestreo, la organización cronológica, el número de muestras por lote y los objetivos específicos. De este artículo extraigo las siguientes consideraciones sobre la técnica ELISA:
- Las pruebas ELISA son muy eficientes en general para detectar tendencias, pero en muchos casos (Para muchas enfermedades no deben usarse como única herramienta diagnóstica).
- Debe tenerse en cuenta que las pruebas ELISA son en general muy sensibles y por ello deben confirmarse los resultados positivos por otros medios cuando las pruebas ELISA se utilizan como prueba diagnóstica. Tal es el caso de la influenza aviar, laringotraquitis, Pasteurella multocida y leucosis aviar entre otras.
http://www.microclin.com/archivos/interpretacion_de_examenes_serologicos_en_campo_Dr_G_Zavala.pdf
Estas consideraciones del Dr. Zavala, muy seguramente están relacionadas tanto con la sensibilidad, (que aunque él no suministra datos, afirma que ELISA es un técnica muy sensible), como con la especificidad. Creemos que lo que el Dr, Zavala afirma está relacionado con el hecho de que no sabemos que antígeno está pegado a los pozuelos en las placas de ELISA y por tanto la respuesta serológica detectada podría estar dirigida contra un serotipo de un antígeno paro no contra los demás serotipos.
Uno de los mejores artículos encontrados al revisar el tema de ELISA como técnica serológica es escrito por el Doctor Javier Torrubia Díaz. "Los resultados serológicos. Limitaciones y aplicaciones prácticas para la enfermedad de Gumboro". El doctor Torrubia explica las limitaciones y las aplicaciones prácticas para la enfermedad de Gumboro. Del artículo extraje los siguientes items:
- Existen diferentes kits comerciales. El kit seguramente más utilizado es de origen norteamericano, utiliza como antígeno el mismo que se usa en una vacuna intermedia clonada. Si se utiliza este kit y se ha empleado esta vacuna, los títulos son mayores que si se ha vacunado con otras cepas, por ejemplo la Lukert o la S-706
- Hay otro kit producido en Holanda. En condiciones normales genera títulos más altos que el primer kit mencionado.
- Hay diferencias entre los kits y los anticuerpos detectados. El virus de Gumboro tiene una genoma que codifica para cinco proteínas: VP1 a VP5. la proteína VP2 tiene epítopes que son capaces de inducir la formación de anticuerpos neutralizantes protectivos y son determinantes del serotipo; el sitio antigénico responsable está en una región pequeña conocida como dominio variable de VP2, altamente dependiente de la conformación. VP3 es una antígeno específico de grupo, reconocida por anticuerpos no neutralizantes, que pueden reaccionar en forma cruzada con los demás serotipos.
- Los kits clásicos utilizan en sus placas antígenos derivados de cepas clásicas replicadas en cultivo de tejidos.
- Los kits clásicos aunque detectan casi todos los anticuerpos frente a las diferentes VP, sobretodo detectan anticuerpos anti-VP3
- Hay nuevos kits norteamericanos que utilizan un antígeno clásico de una cepa derivada de bolsas nativas, el cual permite una detección más precisa de los anticuerpos anti-VP2 protectivos.
- En las vacunas vectorizadas, un gen que codifica para la proteína VP2 del virus de Gumboro es vehiculizado en un virus diferente del de Gumboro (HVT o herpesvirus de pavo). Cuando la respuesta serológica inducida por estas vacunas se mide con los kits clásicos, la respuesta serológica es menor que la que se obtiene cuando las aves se vacunan con las cepas clásicas.
- Cuando la respuesta por anticuerpos generada por vacunas vectorizadas se miden con un kit adecuado (Diferente de los kits cláscos), la respuesta serológica es más temprana y mayor.
De lo planteado en los párrafos anteriores, se deduce que hay que tener en cuenta el tipo de vacuna empleado y la técnica de ELISA empleada. Esto es para mejorar la probabilidad de que las cosas se están llevando a cabo en la forma adecuada; no obstante esto no soluciona el vacío que existe en el sentido de que no sabemos cual es la especificidad de ELISA, es decir no sabemos si los anticuerpos son bajos o la prueba es negativa porque los anticuerpos no son homólogos con relación al antígeno pegado en los pozuelos de las placas.
En este sentido, el doctor Carlos Gómez D. Gerente de Aves y Cerdos para América Latina de una importante compañía productora de Kits de ELISA afirma lo siguiente:
- "Actualmente existen 5 o 6 compañías líderes en el mundo que producen vacunas aviares de excelente calidad, esto no significa que una vacuna sea mala o buena".
- "Lo que tenemos que ver es si elegimos la vacuna adecuada, si tenemos la información de la fórmula de esta, sabemos cuál es el título, sabemos cuál es la vía de aplicación adecuada, etc."
En lo personal, creo que cuando los expertos de una casa comercial productores de vacuna e inclusive productores de kits para el diagnostico serologico ELISA presentan la bondad de una técnica o de una vacuna, muestran resultados con base en la especificidad de la técnica respecto de la vacuna, es decir miden anticuerpos para una vacuna, con kits que tienen antígenos homólogos respecto del virus usado en la vacuna. Esto no necesariamente sucede en el campo, donde pueden estar actuando otros virus de la misma enfermedad.
Hasta aquí se presenta lo inherente a la técnica. Asumiendo que la técnica ELISA empleada va a dar los resultados adecuados en términos de especificidad, es necesario contar con herramientas adicionales a los resultados que arroja la tirilla de la lectora y que finalmente se presentan al usuario en forma de un histograma de frecuencia de los niveles de anticuerpos.
Los informes que emite el software con los que se leen las pruebas ELISA, deben mostrar los siguientes datos:
- Media aritmética.
- Media geométrica.
- Desviación estándar.
- Coeficiente de variación.
- Título mínimo.
- Título máximo.
Figura No.8. Ilustra el concepto de coeficiente de variación que permite correlacionar la concentración de anticuerpos y su distribución en una curva de dispersión de datos. |
El coeficiente de variación es una medida de dispersión útil para comparar dos escalas distintas que están correlacionadas estadísticamente con un factor común. El coeficiente de variación:
- Permite analizar la uniformidad de los títulos de anticuerpos detectados.
- Es un excelente método para determinar la efectividad de un programa de vacunación.
- Indica la uniforme que fue el proceso de inmunización.
- Permite evidenciar cuándo los títulos se salen de los valores consideran normales.
- Para establecer cuándo un lote es serológicamente positivo.
Tabla No. 1 Ilustra el rango de % del coeficiente y la calificación del mismo. http://www.microclin.com/archivos/interpretacion_de_examenes_serologicos_ELISA_D_L_E_Ristow.pdf |
- Si la media geométrica tiene cifras muy bajas, el coeficiente de variación tiene cifras altas: aves no vacunadas, con un desafío bajo.
- Si la media geométrica tiene valores medios y el coeficiente de variación igualmente tiene valores medios: se podría estar en el caso de un desafío con antígenos débiles, con el uso de vacunas vivas; el análisis se hace frente a los métodos de vacunación.
- Si la media geométrica tiene valores altos, el coeficiente de variación debe tener cifras bajas. Posibilidades: el antígeno vacunal es potente o se usan vacunas con diferentes adyuvantes, la media geométrica será alta y el coeficiente de variación bajo.
- Contiene la información necesaria para interpretar correctamente los resultados de pruebas serológicas, con base en lo cual se toman decisiones
- Es un conjunto de datos que representan los niveles históricos o niveles iniciales de una cantidad medible.
- Es usada como base para comparar nuevos datos obtenidos subsecuentemente: por ejemplo la respuesta a una intervención o programa.
- Debe ser usada en forma continua en una empresa.
- Se debe elaborar por granjas, por regiones identificadas geográficamente.
- Varía de acuerdo con el tipo de explotación (Ponedoras, pollo de engorde, reproductoras) y con la edad de las aves.
- Debe elaborarse con resultados de aves sanas , con buenos indices de producción.
- Se elaboran con base en el promedio geométrico.
- Se debe trabajar con el mismo número de sueros.
- Se debe elaborar con resultados del mismo laboratorio, en las mismas condiciones y con el mismo kit.
http://www.actualidadavipecuaria.com/articulos/uso-de-la-serologia-como-herramienta-en-medicina-preventiva-aviar.html
Anteriormente se hizo referencia a un trabajo del Doctor Guillermo Zavala sobre interpretacion de exámenes serológicos.
http://www.microclin.com/archivos/interpretacion_de_examenes_serologicos_en_campo_Dr_G_Zavala.pdf
El doctor Zavala escribió una serie de consideraciones relacionadas con la técnica ELISA para una casa comercial productora de kits para la prueba serológica y con base en ellas se elaboró un poster o afiche del cual se extrajeron textualmente estas:
- ELISA es una herramienta valiosa para observar tendencias de seroconversión.
- Toda variación significativa en el desafío de campo o los enfoques de vacunación se pueden detectar con el uso de ELISA.
- ELISA no determina subtipos de las respuestas inmunológicas contra cepas específicas variantes.
- ELISA no puede determinar si las aves de corral con problemas de bronquitis fueron desafiadas con un serotipo Massachusetts, Arkansas, Connecticut, DEO72, etc.
- ELISA no es una prueba cuantitativa en el sentido de que no puede determinar específicamente contra que cepa, serotipo o variante se dirigen los anticuerpos.
Imagen No. 1. Es una fotografía tomada del poster o afiche al que hacen mensión los párrafos anteriores. |
- Los valores del ensayo por ELISA se pueden usar del siguiente modo:
- Como referencia para tendencias de seroconversión en una empresa de avicultura con desafíos de campo.
- Para identificación de seroconversión rápida en muestras duplicadas de animales graves y convalescientes en una situación diagnóstica.
- Para evaluación de vacunas y procedimientos de aplicación de vacunas.
- Para documentación de la ausencia de anticuerpos contra agentes patógenos.
En el caso de la enfermedad de Gumboro sucede lo mismo en cuanto a la especificidad de la técnica: si no hay correspondencia entre los anticuerpos circulantes y el antígeno pegado en el fondo de los pozuelos de las placas de ELISA, no se produce la reacción antígeno-anticuerpo y la reacción no se puede visualizar de acuerdo con lo que se expone en párrafos anteriores y en la figura No. 4.
En la enfermedad de Gumboro, la protección conferida por la vacunación está relacionada con la formación de la proteína viral 2 (Por sus siglas en inglés VP2), que es el mayor determinante antigénico del virus. La VP2 induce anticuerpos neutralizantes capaces de controlar la enfermedad y las características individuales de esta VP2 en las distintas cepas determina su fenotipo y su virulencia. Es por esto que se hace necesario caracterizar las diferentes cepas de la enfermedad infecciosa de la bolsa de Fabricio circulantes en un área geográfica para establecer las medidas de control adecuadas
http://www.scielo.org.ve/
De hecho, cuando hay una infección de campo, la VP2 tiene una conformación que induce anticuerpos que inmunológicamente son complementarios con las características inmunogénicas de esa proteína, la cual varía de un tipo de virus a otro de la enfermedad de Gumboro. El kit ELISA que se usa en el laboratorio debe reproducir en sus placas lo mismo que sucede en condiciones de campo.
Buenas noches soy de Paraguay.
ResponderEliminarMuy interesante y util todas las explicaciones.
Gracias por compartir todos sus conocimientos.